Name: olfactory behaviors assayed by computer tracking of drosophila in a four-quadrant olfactometer
Uploaded: 2016-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer at JoVE.com

We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundstr&#246;m at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

1. הגדרת עצרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור בזירה בצורת כוכב (19.5 ס&quot;מ על 19.5 ס&quot;מ על 0.7 ס&quot;מ) מתוך polytetrafluoroethylene (PTFE) פי (חומרים משלים, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) ציור מסופק. הזירה עשויה להיות מיוצרת על ידי בפרסומת או מתקן מותאם אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת שתי צלחות זכוכית (20.25 ס&quot;מ על 20.25 ס&quot;מ עם עובי של 2 מ&quot;מ), לקדוח חור (~ 0.7 ס&quot;מ קוטר) בדיוק במרכז אחד מלוחות הזכוכית באמצעות המקדח מצופה יהלומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור תיבת התנהגות אור חזק עבור התנהגותית. גם לייצר קופסות מצלמת אור חזקה עבור מצלמת וידאו CCD-אדום אינפרא לי תרשים סיפק (חומרים משלימים, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). התיבות עשויות להיות מיוצרות על ידי מסחרי או מתקן מותאם אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקין את יחידת המזגן על הקיר האחורי ואת מערכי LED על הקירות הצדדיים של תיבת ההתנהגות. מניח את חללית הטמפרטורהבתיבת התנהגות דרך חור בצד משוב וכוונון טמפרטורה בזמן אמת (ראה איורים 1 ו -2 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מסנן IR ו מקטב מעגלי למצלמה, ולעגן את המכלול לתוך תיבת המצלמה. תיבת התנהגות תיבת מצלמה מופרדת חלון זכוכית עבור בקרת טמפרטורה טובה יותר של תיבת ההתנהגות (ראה איורים 1 ו -2 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מצלמת CCD אינפרא האדומה למתאם מצלמה. חבר את מתאם מצלמת ממיר USB. חבר את ממיר ה- USB ליציאת USB במחשב לרכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את מנהל ההתקן עבור ממיר וידאו במחשב על פי הוראות היצרן. לחלופין, להתקין תוכנות עיבוד תמונה שסיפק היצרן של ממיר וידאו USB לגשת למגוון רחב יותר של הגדרות המצלמה ופרמטרים הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את יחידת המזגן (באמצעות &quot;פלט&quot;על גביו של בקר טמפרטורה) ואת בדיקת הטמפרטורה (באמצעות&quot; תרמי &quot;בגב בקר טמפרטורה) אל בקר הטמפרטורה. מניח את החללית לתוך תיבת ההתנהגות. הערה: מערכת בקרת הטמפרטורה בפריסה שלנו היא מסוגלת לשמור על טמפרטורת התיבה בין 18 ° C ו- 30 ° C. כאשר טמפרטורה סביבתית גבוהה או נמוכה יותר יכולה להיות שימושית עבור thermogenetic (dTrpA1, TS TrpM8 או shibire) ניסויים לתמרן פעילות עצבית או לעכב בשידור סינפטי. עבור רוב הניסויים, הטמפרטורה נשמרת על 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכיבו את מערכת המסירה ריח בשלבים הבאים (ראה איור 1B עבור שרטוטים מפורטים ואביזרים חיבור): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ווסת לחץ האוויר לשלוט קלט האוויר ממערכת האוויר המרכזית. חבר מסנן אוויר פחמן (מלא פחם) אל ווסת הלחץ כדי לטהר את האוויר מן המרכזימערכת ir. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את מערכת בקרת זרימה המורכבת של ערוצים מרובים מוסדרים על ידי צינורות flowmeter ברזולוציה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את יציאת ממסנן האוויר פחמן אל צינורות flowmeter דרך סעפת כפי שמוצג באיור 1B ו 2F. כוון את הפלט של צינורות flowmeter דרך שסתומי סולנואיד 3 כיוונים נשלטו אלקטרוני להסדיר אם אוויר נקי לעזוב את למדידת התצרוכת מסולק לחדר או התקשר תאי ריח מחוייט 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את בקר שסתום סולנואיד פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מד זרימת האוויר האלקטרוני על ידי חיבורו להתקן רכישת נתונים (DAQ) וכן אספקת חשמל בהתאם למדריך של היצרן. התקן את תוכנת ממשק DAQ לאמת ספיקות שווות בכל רבע של הזירה לפני כל ניסוי. </li></ol> 2. הכנת גירויי חוש ריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריח 5תאי נמלה 24 מורכבות של מכל חיצוני פלסטיק, זכוכית מיכל פנימי, להכניס מכסת מחוייט PTFE, מכסה מיכל מקורי עם חלק מרכזי הוסרו, ושני שסתומים חד כיווניים. הערה: O-Ring מסביב למכסת PTFE יכול לשמש כדי למנוע דליפת אוויר מאולם הריח במהלך זלוף ריח. ראה איור 1 עבור סכמטי באיור 2 לתמונות של תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ארבעה תאי odorant עבור פקדי ממס, קאמרית אחת עבור odorant הבדיקה. מלאו את מיכלי זכוכית עם 1,000 μl של דילול ממס או odorant (ניחוחי מבחן + ממיסים המתאים, ומערבבים היטב לפני ניסויים), מניחים את מיכל זכוכית בפנים הקאמרית פלסטיק המקביל (לא לשפוך את הנוזל לתוך תא פלסטיק) והדק את המכסה . הקפד תמיד להשתמש בתא נקי עבור odorant מבחן ובקרות ממס. הערה: משיכת חוש ריח יכולה להיות מופעלת על ידי 1/16 דילול של חומץ תפוחים (5% חומציות) ב wאטר. לעומת זאת, התנהגות דחייה חוש הריח עלול להיחקר באמצעות דילול 10% של propionate אתיל בשמן מינרלי. גירויי בקרה במקרים אלה הם תאי ריח עם שמן מינרלים טהור. </li></ol> 3. הכנה טס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחורי זבובים על מדיום קמח תירס רגיל. מניח 30 זכר 30 זבובים הוריים נשיים בקבוק סטנדרטי, ולתת להם להטיל ביצים במשך 5 ימים של 25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ניסוי, לאסוף eclosed החדש (&lt;1 יממה) 25 גברים ו 25 נשים זבובים בהרדמה CO 2 קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור זבובי בקבוקון עם מדיום לטוס תקן 2-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40-42 שעות לפני הניסוי, להעביר את הזבובים בלי CO 2 הרדמה &#160; בקבוקון עם ג&#39;ל agarose ~ 10 מ&quot;ל 1%. זה ישמור על הזבובים humidified ללא מזון, אשר מסייע להגביר את הפעילות של התנועה שלהם. הערה: יותר מ -90% של הזבובים צריכים לשרוד את הרעב. גנוטיפים חלקם פחות לרפאעמך וייתכן שלא לעשות את זה דרך רעב 40 שעות. במקרים אלה, לתקופות קצרות כגון 24-28 שעות תתקבלנה, אבל צריך להישמר זהה עבור כל התנאים והחוזרים ניסיוני. </li></ol> 4. תגובות התנהגותיות ניחוחות אטרקטיביים ודוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בקר הטמפרטורה ולהגדיר אותו ל -25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את תאי odorant (ניחוחי מלא בדיקה) על ידי החדרת צינורות לשקע של תא odorant ואל שכיבות כדי להתחבר הולם על קופסא ההתנהגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את קצב הזרימה בכל רבע באמצעות מד זרימת אוויר לוודא כי מלאה איירסטרים odorant שווים ל -100 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הזירה PTFE זבוב ואת לוחות זכוכית עם 70% 2-3 פעמים אתנול ולאפשר להם אוויר יבש לגמרי (~ 3-4 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את לוחות הזכוכית לזירה עם מהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים בלי CO 2 הרדמה לזירה דרך החור אחד מלוחות הזכוכית. אָחוֹראה ההעברה, להציב רשת מעגלית על החור כדי למנוע זבובים לברוח. הערה: הרדמת CO 2 הוכחה כדי להשפיע על התנהגות תסיסנית 25 ולא אמור לשמש תוך 24 שעות של ניסוי התנהגותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הזירה עם זבובים לתוך תא האור חזק, לחבר את זרמי אוויר ארבע שליטה על ידי חיבור הצינור המחובר אל שכיבות כדי להתחבר הולם על קופסא ההתנהגות לפינות הזירה, לסגור את הדלת של החדר ולחכות 10- 15 דקות כדי לתת את הזבובים להתאקלם בסביבה החדשה. במידת האפשר, כיבתה את האורות בחדר שבו הניסויים מבוצעים, כדי למנוע דליפת אור מינימלית האפשריים שעשויים להטות את התוצאה הניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ניסוי בניהול 5-10 דקות, שבו זבובים נחשפים פרצי אוויר 4 שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים באופן מיידי (ראה סעיף ניתוח נתונים להלן) כדי לוודא כי הזבובים מופצים באופן אחיד בזירה, ואת משיכת האינדקס קרובהצעד ל -0 זה חיוני, כפי שהוא מוודא כי אין מקורות בלתי מבוקרים של העדפה או הימנעות בתוך הזירה (למשל חדר אור דולף מבחוץ, התפלגות טמפרטורה אחידה, בזירה אחידה, זיהום ריח, וכו &#39;). אם הזבובים מופצים שוויוניים או הפעילות של התנועה שלהם היא נמוכה, לבטל את הזבובים, לנקות את הזירה שוב (שלב 4.4) ולהשתמש קבוצה חדשה של זבובים לחזור על הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את תא odorant המבחן כדי ההתקנה כשיפעיל שסתומי 3 הכיוונים או מחדש חיבור הצינורות המחברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ניסוי מבחן למשך 5-10 דקות ולנתח את הנתונים כפי שפורט בסעיף 5 להלן (ראה גם הפניה 14 ו איור 3). הקלטות ארוכות מ -20 דקות יכולות לגרום קבצי נתונים שעשויות להיות קשה תהליך מחשוב. אם הקלטות ניסיוניות יותר הם רצויות, במהירות לעצור מחדש להפעיל את תכנית המעקב. התוצאה היא פער ~ 10 שניות בין הקלטות ניסיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Discarזבובים ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזירה וזכוכית נקיות צלחות עם אתנול 70% (שלב 4.4), ולהחליף צינורות מחבר בתוך מתחם האור חזק. כדי לזרז את ניסויים, זירה נקיה חדשה יכולה לשמש, ובזירה המלוכלכת לנקות בעת ביצוע ריצות ניסיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ניסוי נוסף עם קבוצה חדשה של זבובים, אם נדרש. אם מספר ניסויים מנוהלים באותו היום, לקחת בזהירות רבה, כדי לוודא ששום odorant נשאר במערכת מריצת בדיקה קודמת. זה בדרך כלל לא בעיה עם ריכוזים נמוכים של ניחוחי או עם CO 2, אבל עבור מרוכז מאוד גירויים עד פער 24 שעות בין ריצות ניסיוניות עשויים להיות נחוץ. בנוסף, כל הצינורות לאחר צינורות הזרימה יכולים להיות מוחלפים אם זיהום odorant חשוד במהלך ניסויים שליטים. תמיד להשאיר באוויר היבש בין הניסויים כדי לרוקן את המערכת באופן רציף </li></ol> ניתוח 5. נתונים הערה: softwar רכישת מעקב זבוב הציעדואר (המפורטים חומרים), עוקב אחר הזבובים בזמן אמת במהלך הרכישה, ושומר את חותמת זמן הקואורדינטות של כל הזבובים מזוהה בפורמט .dat *. פיתחנו שגרה מחוייט Matlab כדי להמיר את הנתונים לפורמט Matlab, ולנתח את הנתונים. דוגמאות קוד ניתנות חומרים משלימים, אך פרטים של יישום יהיו תלויים בתוכנה המשמשת לרכישת נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הנתונים הגולמיים. יצירת מסכה מרחבית, בהתאם לקווי המתאר של הזירה ולהחיל את המסכה על הנתונים הגולמיים כדי להסיר את כל נקודות נתונים שנופלים מחוץ לזירה כפי שהם מייצגים רעש (איור 4 א, ​​משלים קוד MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל נקודות נתונים שנעים במהירות מתחת 0.163 ס&quot;מ / s עבור יותר -3, מכיוון שמידע זה עשוי להיות רעש או שנוצר על ידי זבובים שאינו זז (איור 4 ב &#39;, משלים קוד TemporalFiltering.m). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו נתונים הנותריםנקודות על ידי התוויית אותם בבת אחת או כמו מסלולי יחיד (איור 3, קוד משלים SingleTrajectoryViewer.m). הערה: המיקום של גבולות ריח של שדה ארבעה תלוי סביר על מספר גורמים, כגון המאפיינים של כל odorant ושיעורי זרימת האוויר בשימוש. לדוגמא, ניחוחי בתנודתיות גבוהה ימלא ברבע הריח סביר באופן מלא יותר מאשר ניחוחי תנודתי פחות. לפיכך סביר להניח כי כל odorant עשוי להפגין גבולות ריח שונים במקצת. השימוש בגלאי photoionization למדוד גבולות ריח יכול להיות בעייתי כפי שהיא משתמשת בוואקום לדגום אוויר מנקודה מסוימת, וכך משבש את הריכוז odorant בנקודה זו. עם זאת, גבולות ריח יכולים יוערכו בהתבסס במהירות על נתונים התנהגותיים זבוב. לדוגמא, גבול ריח המבוסס על מסלולי זבוב שנצברו בתגובת ריחות שונים ניתן להבחין בבירור 3C דמויות 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קאלculate אינדקס משיכה כדי לקבוע אם ניסויים שליטים לייצר שום תגובת העדפה, וגם לגשת בתגובת odorant (או 9 optogenetic) גירוי. כדי לחשב אטרקצית האינדקס (AI), להשתמש ב -5 הדקות האחרונות של הקלטה מלאה או בדיקה. כדי להשיג מידה של משיכה שנופלת בין +1 (משיכה מוחלטת) ו -1 (דחייה מוחלטת), הנוסחא הבאה משמשת לחישוב AI: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> שם בדיקת N היא מספר נקודות נתונים ברבע הבדיקה, בקרת N הוא המספר הממוצע של נקודות נתוני הרביעים המלאים השלושה. צעד זה הוא אינטואיטיבי כמו העדפה תצוין ערכים אפסיים. עם זאת, זה לא נכון לציין את חלקם של המספר הכולל של זבובים ממוקמים ברבע odorant. כדי להשיג מידה זו, אחוז במדד (PI) ניתן להשתמש: <img alt="משוואה 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg&quot; /&gt; שם בדיקת N היא מספר נקודות נתונים ברבע הבדיקה, ומוחלט N הוא המספר הכולל של נקודות נתונים בכל ארבעת הרביעים. נוסחה זו מספקת מדד שנופל בין 0 ל -1, עם 0.25 המתאים אין העדפה התנהגותית (איור 3E ו 4C, משלים קוד AttractionIndex.m). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 5-10 חזרות על כל תנאי הניסוי, באמצעות קבוצה חדשה של זבובים לכל חוזרים. השוואת מדדי משיכה בין התנאים או נגד שולטת באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב הלא פרמטרית (איור 3F, פונקציה kstest2 ב- Matlab). </li></ol>

<ol>
	<li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution.">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).</li><li>Thorpe, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+studies+on+pre-imaginal+olfactory+conditioning+in+insects.">Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects.</a> Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).</li><li>Tully, T., Quinn, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+conditioning+and+retention+in+normal+and+mutant+Drosophila+melanogaster.">Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster.</a> J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).</li><li>Anholt, R. R., Mackay, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+analyses+of+complex+behaviours+in+Drosophila.">Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila.</a> Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).</li><li>Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Into+the+mind+of+a+fly.">Into the mind of a fly.</a> Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).</li><li>Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+monitoring+and+analysis+of+social+behavior+in+Drosophila.">Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).</li><li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila.">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li><li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila.">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, e04580 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering:+Drosophila+melanogaster+and+beyond.">Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).</li><li>Diao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+genetic+access+to+drosophila+cell+types+using+exchangeable+exon+cassettes.">Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes.</a> Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).</li><li>Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+odors+trigger+Drosophila+males+to+deposit+a+pheromone+that+guides+aggregation+and+female+oviposition+decisions.">Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Pettersson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+aphid+sex+attractant.">An aphid sex attractant.</a> Insect Systematics &amp; Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).</li><li>Semmelhack, J. L., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Select+Drosophila+glomeruli+mediate+innate+olfactory+attraction+and+aversion.">Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion.</a> Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).</li><li>Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+airflow+olfactometer+for+measuring+olfactory+responses+of+hymenopterous+parasitoids+and+other+small+insects.">An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects.</a> Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).</li><li>Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+of+Drosophila+to+biogenic+levels+of+carbon+dioxide+depend+on+life-stage,+sex+and+olfactory+context.">Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).</li><li>Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+processing+streams+in+Drosophila+are+behaviorally+specialized.">Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized.</a> Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).</li><li>Gao, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+kinematics+and+motor-related+neurons+for+aversive+chemotaxis+in+Drosophila.">Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila.</a> Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).</li><li>Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+sparse+olfactory+inputs+are+sufficient+to+mediate+innate+aversion+in+Drosophila.">Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila.</a> PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).</li><li>Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesol-detecting+olfactory+neurons+in+Drosophila.">Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).</li><li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+and+expanded+Q-system+reagents+for+genetic+manipulations.">Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations.</a> Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).</li><li>Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+building+an+inexpensive+computer-controlled+olfactometer+for+temporally-precise+experiments.">Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments.</a> Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).</li><li>Colinet, H., Renault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+effects+of+CO2+anaesthesia+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster.</a> Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).</li><li>Ramdya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+interactions+drive+collective+behaviour+in+Drosophila.">Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila.</a> Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).</li><li>Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+place+learning+in+Drosophila+melanogaster.">Visual place learning in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).</li><li>Beshel, J., Zhong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graded+encoding+of+food+odor+value+in+the+Drosophila+brain.">Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain.</a> J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).</li><li>Steck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+behavioral+paradigm+for+Drosophila+olfaction+-+The+Flywalk.">A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk.</a> Sci Rep. 2, 361 (2012).</li><li>Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Quantification+of+Odor-guided+Behavior+in+Drosophila+melanogaster+Using+the+Flywalk+Paradigm.">High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm.</a> J. Vis. Exp. (106), (2015).</li><li>Claridge-Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Writing+memories+with+light-addressable+reinforcement+circuitry.">Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry.</a> Cell. 139 (2), 405-415 (2009).</li><li>Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+discrimination+in+Drosophila:+from+neural+population+codes+to+behavior.">Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior.</a> Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

אולפקטומטר ארבע השדה המתוארת כאן הוא מערכת התנהגותית צדדית ללימוד תגובות חוש הריח של אוכלוסיות גדולות של wild-type ו מוטצית תסיסנית זבובים. כל ניסוי לוקח ~ 1 hr (כולל התקנה, ריצות ניסיון, וניקוי), ו 4-6 ניסויים ניתן לבצע באופן שיגרתי בכל יום. Assay טיפוסי באמצעות 40-50 זבובים במשך 5 דקות מייצר כ -450,000 במעקב נקודות נתונים לצורך ניתוח. תצורת המתוארים יכולה לשמש גם, עם שינויים קלים, כדי לפקח על תנועות של חרקים אחרים או זחלי חרקים בתגובת חוש ריח או גירויים חושיים אחרים על פני פרק זמן, החל דקות עד ימים. את assay הארבעה ברבע רגיש להשפעות של שני גירויים אטרקטיביים ודוחים. רוב ניחוחי ליצור אינדקסים משיכה (AI) בין -0.9 ו 0.9 (משוואה 1). AI בטווח של +0,5 כדי +1 מסמל התנהגות משיכה חזקה של זבובים לגירויים, ואילו AI בטווח של -0.5 ל -1 הואמופעל על ידי דוחים חזקים. באופן כללי, תגובה ניטראלית על ידי ריחות מלאים (אוויר יבש, אוויר humidified, שמן מינרלים) צריכה לנפול בין 0.1 ו -0.1. את AI לעתים קרובות משתנה לאורך כל תקופת ניסוי הבדיקה, המשקף את זמן זבובים דורשים ללכת לתוך נוצות odorant, משיכת גידול ראשונית של פעילות של תנועה כלפי גירוי רומן, ואת ההקהיה הסופית בתגובה לגירוי. ריצות מלאות טרום בדיקה חיוניות, וחייבות להתבצע בזהירות על מנת להבטיח כי זבובים היו מפוזרים באופן אחיד בזירה בהעדר הגירוי הרצוי. רוב הגורמים השכיחים של הטיה מרחבית של זבובים בזירה הם: פרצי אוויר אחיד, ככל הנראה בשל צינורות מנותקים או צלחות זכוכית הידק כראוי של הזירה בצורת כוכב (מניסיוננו, זבובים מסוגלים לזהות חילוקי זרימת האוויר של מעט ככל 15 mL / min); התפלגות טמפרטורה אחידה על פני הזירה, כי ניתן לשפר על ידי קביעהמזגן יחיד ליצור חלשה יותר מפוזרת זרימת אוויר ו / או בתקופה שלפני רכישה יותר (~ 20 דקות) כדי להבטיח אפילו בטמפרטורה של הזירה; זליגת אור מינימאלית דרך פתח בדיקת הטמפרטורה, כי עשוי להיות מופחת על ידי אטימת פתח עם סרט שחור; ריח שיורית בזירה או במערכת אספקת אוויר, ובמקרה ההתקנה (בזירה, flowtubes, אביזרי של המתחם אור חזק, וכו &#39;) יש לנקות ביסודיות להתייבש במשך כמה ימים או להחליף במידת האפשר. תחזוקה של ציוד חוש הריח חשובה תוצאות אמינות ועקביות. Push-to-להתחבר אבזרים על קופסא התנהגות צריכת אוויר קירות פנימיים של הזירה יש לנקות עם אתנול לאחר כל ניסוי אם משמשים ריחות חזקים, להתייבש לחלוטין. לוחות הזכוכית יש לשטוף שלוש פעמים עם אתנול 70%, וזה בדרך כלל מספיק כדי להסיר ריח שיורית ולכלוך מהצלחות, אבל הקסאן שימושיבהסרת תרכובת אורגנית שהופקדה על ידי זבובים (למשל, פרומונים המורכבים שרשרות פחמימנים ארוכות). סבון הוא בדרך כלל לא מומלץ משום שהוא מכיל בדרך כלל רכיבים ארומטיים, שישפיעו התנהגויות חוש ריח. תיבת ההתנהגות צריכה להישאר מחוברי צריכת האוויר היבש בין ניסויים (למשל הלילה) כדי להקל על הסרת ריחות שיורית מהמערכת. אם הפעילות של התנועה של הזבובים היא נמוכה, הם עלולים ליצור מעט מדי נקודות נתונים, אשר לעתים קרובות תוצאות מדד משיכת רועש משתנה. פעמים מרעב הקלטה ארוכות יותר עשויות לעזור לפתור את הבעיה הזו. לעומת זאת, אם הזבובים חולים, 24-28 שעות ברעב תהיינה בדרך כלל מספיק עבור שיפור פעילות תנועה כל עוד הוא עולה בקנה אחד ברחבי ניסויים. ישנו איזון עדין בין שמירה על מצב בריא של הזבובים והגדלת תנועה. 40 שעות רעב יכול לשמש כנקודת התחלה, ולאחר מכן שונה כמועולה צורך בכך לאור תוצאות הניסוי. אינדקסי משיכה יושפעו מעט וממשך רעב, ולכן הוא חיוני כדי להרעיב את כל חיות הניסוי באותה התקופה של זמן על מנת למנוע תופעות של בלבול זמן רעב. פעמים רעבות כבר בדרך כלל לבצע תגובות דוחות חלשות יותר (קרוב ל -0), ותגובות אטרקטיביות חזקות. זרמי אוויר בקרת האוויר יבשים נוטים לייבש הזבובים, ולא אמור לשמש למשך זמן ארוך יותר מ -40 דקות. אולפקטומטר הארבעה ברבע ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובות של זבובים יחידים 16,18 או מרובים כדי גירוי יחיד או ללמוד העדפת בחירה בין גירויים. לדוגמא, ריחות שונים יכולים לשמש כל אחד מהארבעה-הרביעים. זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את התגובות-תערובות ריח ידי בחינת הגבולות-רביעי הריח. יצוין כי למרות מערכת המעקב מאפשרת שירים בודדים כדי להיות מבודדים מן הנתונים שנאספו, זהייתכן כי זבובים בודדים עשויים להתנהג באופן שונה כאשר assayed כחלק מקבוצה מאשר כאשר הם נבחנים לבד. לדוגמה, קבוצות של זבובים תפגין גדל ודחייה מונחה ריח בשל אינטראקציות פיזיות בין זבובים 26. מערכת המעקב והפריסה יכולים גם להיות מותאמת לשימוש מבחנים שאינם חוש ריח. מסגרת assay יכולה להכיל מערך LED בקלות 9 לגירוי optogenetic, או צלחת תרמית 27 עבור thermogenetics. המערכת עשויה גם להיות מותאמת ללמוד בחירות התנהגותיות של ציר זמן של רבי hr, למשל ללמוד התנהגות הטלת 14. במקרה זה, את מסגרת דולר הרכישה צריך להיות מותאם, כדי למנוע את הדור של קובצי נתונים גדולים, ומקור לחות המצע (ג&#39;ל 1% agarose) צריכים להינתן כמו מצע הטלה. הגבלה של התקנה זו היא כי הזבובים מתבצע המעקב אחר כמו IR-חפצים מחזירי אור ב ומתחת arena- אם כל אלמנט של optogenetic אוניסוי thermogenetic משקף אינפרא אדום, נקודות הנתונים הרלוונטיות יהיה צורך להסירו במהלך שלאחר עיבוד. בשלב זה הוא גם לא ניתן לצלם זבובים ברזולוציה מרחבית המאפשרת זבובים שונים כדי שניתן יהיה להבחין ברציפות, אבל זה עשוי להשתפר בעתיד באמצעות מצלמות וידאו מתקדם יותר. מגבלה נוספת של המערכת הנוכחית היא שהתנועה של זבובים היא מוגבלת בשני ממדים לקדם התנהגויות הליכה, ותמנע תגובות טיסת הרחה-induced. יצוין כי מבחנים אוטומטיים נוספים גם פותחו כדי לחקור את התנהגות חוש הריח של יחיד או קבוצות של זבובים. העיצוב הדומה ביותר assay המתוארת כאן היא שיטה שפותחה על ידי Beshel ו ונג 28. ב assay זה, התגובות של ~ 30 זבובים מנוטרות בתוך זירה עגולה קטנה (בערך רבע באזור של זירת הארבעה-השדה) שבו ריחות מועברים מן 1 מתוך 4 יציאות ריח לאורך wa בזירהll, והוציא דרך חור במרכז הזירה המעגלית. מלבד בזירה קטנה, הבדלים עיצוביים אחרים כוללים התנהגויות המבוצעות בתנאי אור, ניחוחי בעיקר להתרכז קרוב ליציאות הריח (במקום לאורך כל הרבע odorant כפי שהורה הקירות המכווצים של זירת הארבעה-השדה). עם זאת, בזירה החוזרת הנה שיטה מתאימה להקרנת תגובות חוש ריח של זבובים, ויכולה להיות מותאמת לעיצוב מעקב זבוב המתואר כאן. גישה חלופית היא לפקח על הפעילות בו זמני של זבובים יחידים רבים בתגובה לריחות. ב assay Flywalk, זבובים הפרט ממוקמים צינורות קטנים, והתגובות שלהם במעקב כאשר ניחוחי הם perfused דרך הצינור 29,30. שינויים בכיוון קדימה או אחורה, או שינויים מהירויות, יכול להיות מנוצל כדי לאמוד אם odorant הוא אטרקטיבי בדרך כלל או דוחה. assay זה, כמו assay ארבעה-השדה, עוקב מ לטוס באופן אוטומטיovements, וכך ניתן להשתמש כדי למדוד תגובות ריח במהירות למגוון רחב של ריחות. עם זאת, בניגוד הארבעה-השדה, דינמיקה מוטורית מורכבת, כגון זוויות הפיכת מסלול ואינטראקציות חברתיות פוטנציאל, אולי החמיצה בהקלטת assay Flywalk. מעקב אוטומטי של זבובים הליכה אחת גם הותאם על assay ל-ט מבוך 31,32. ב assay זה, זבובים ממוקמים תאים קטנים שבו ריחות perfused מכל צד של החדר, ויציאה דרך יציאה באמצע החדר. העמדות של הזבובים גם מתבצעות מעקב אוטומטי אחרות. מחקה זה, בקנה מידה זבוב אחד, מסגרת T-מבוך. בשילוב עם optogenetics, assay זה כבר גם מתאים במיוחד עבור assaying מעגלים עצביים בתיווך למידה וזיכרון חוש ריח, והוא יכול לשמש גם כדי לאמוד את העדפות חוש הריח של זבובים יחידים. בדומה Flywalk, זה לא יכול לפקח דינמיקת פעילות מורכבת שעלולים להתרחש על פני שטחים גדולים יותר מרחבית, כגון אלה המתרחשים במהלך 14 שוחרת מזון, או התנהגויות המתרחשות רק באוכלוסיות זבוב.

היכולת להסתגל ולהגיב הסביבה החיצונית היא קריטית להישרדות של כל בעלי החיים. בעל חיים צריכים למנוע סכנות, לחפש מזון למצוא בנות זוג, וללמוד מניסיונם הקודם. מערכות חושיות לתפקד לקבל מגוון של גירויים, כגון חזותי, כימי mechanosensory, ולשלוח אותות אלה למערכת העצבים המרכזית צורך לפרש מפוענח. המוח ואז מפנה התנהגויות מוטוריות המתאים בהתבסס על הסביבה הנתפסת, כגון תר אחר מזון או לברוח טורף. הבנה כיצד מערכות חושיות לזהות את העולם החיצוני, וכיצד המוח מפענח ומפנה החלטות, הוא אתגר גדול בנוירוביולוגיה. תסיסנית היא מערכת מודל עוצמה על חקירת התנהגויות מדריך מעגלים עצביים איך. מלבד היותו פשוט וזול יותר לתחזק, תסיסנית תערוכה רבות התנהגויות מגוונות ומורכבות סטריאוטיפיות, עדיין עושה זאת עם compact מערכת העצבים של כ 100,000 נוירונים. טכניקות גנטיות עצמה קיימות מניפולציה של הגנום תסיסנית, ואלף קווים מהונדסים נוצרו כי סלקטיבי reproducibly לתייג אותה תת הקבוצות של נוירונים 10-13. קווים מהונדסים אלה יכולים לשמש כדי לתפעל את הפעילות באופן סלקטיבי של נוירונים שכותרתו (להפעיל או לעכב), ואת המניפולציות האלה יכולים לשמש כדי לחקור התנהגויות מדריך פונקציות איך עצבי. מבחני התנהגות נפוצים פותחו ללימוד התנהגויות תסיסנית שונות. תסיסנית, כמו בעלי חיים רבים, להשתמש בחוש הריח שלהם להדרכת בחירות התנהגותיים רבות, כגון מציאת מזון, מציאת בני זוג, לבין הימנעות סכנות. Olfaction לכן מערכת חושית טובה חוקר כיצד לגירויים חיצוניים מזוהים ופורשו על ידי מערכת העצבים של בעלי חי להנחות בחירות מתאימות. ככזה, מספר מבחני פותחו עבור investigaזחל טינג והתנהגויות הרחה מבוגרת. באופן מסורתי, התנהגויות ההרחה תסיסנית היו assayed ידי פרדיגמת שתי הבחירה T-מבוך, אשר ניתן להשתמש בהם עבור assaying מולד למדו התנהגויות ההרחה 3. ב assay זה, כ -50 זבובים מקבלים בחירה בין שני צינורות: צינור אחד מכיל את הריח מדובר והשני מכיל odorant מלא (בדרך כלל ממס הריח). הזבובים ניתנים לתקופה קצובה של זמן לעשות בחירה, ולאחר מכן את מספר הזבובים הנמצאים בתאים השונים נספר. למרות T-המבוך הוא assay פשוט עבור ניסויים רבים, ישנם מספר מגבלות. לדוגמא, התנהגויות הרחה נמדדות רק בנקודת זמן אחת, ואת האפשרויות שונות שנעשו לפני נקודת זמן זו מבוטלות. בדומה לכך, התנהגויות הפרט של הזבובים בתוך האוכלוסייה מוזנחות. בנוסף, T-המבוך דורש ספירה ידנית של זבובים, אשר עשוי להציג שגיאות. לבסוף, שכן יש רק שתי אפשרויות מדודות, זהמקטין את הכח הסטטיסטי נדרש לעתים קרובות כדי לזהות שינויי התנהגותיים עדינים. חלופת מבוך T ושתיים בחירה היא של ארבעה רביעים (ארבעה-שדה) אולפקטומטר 14-18. ב assay זה, חיות לחקור זירה שבה כל אחת מארבע הפינות של הזירה מתמלאת מקור פוטנציאלי של אוויר odorized. הזירה יש צורת כוכב המכווץ על מנת למקסם את ההיווצרות של ארבעה רביעי ריח מוגדרים באופן ניסיוני. אם ריח מסופק באחת הפינות ואז הוא מוכל רק באותה ברבע אחד. ההתנהגויות של בעלי החיים ניתן לעקוב כפי שהוא להיכנס ולצאת ברבעים הריח, ובקלות לעומת התנהגותם הרביעים המלאים השלושה. את assay אולפקטומטר הארבעה ברבע ובכך רשום בתגובה במרחב ובזמן התנהגותיות לגירויי הריח פני זירה ניסיונית גדולה. אולפקטומטר ארבע ברבע פותחה לראשונה על ידי Pettersson et al. 15 Vet et al. 17 לחקור את olתגובות מפעל התנהגותיים של דבוראים טפילים פרט. Faucher et al. 18 Semmelhack וואנג 16 התאימו את ההגדרה כדי לפקח על התגובות חוש הריח של תסיסנית הפרט. אולפקטומטר הארבעה ברבע רגיש לא פחות לתגובות אטרקטיביות ודוחות, המאפשר מגוון רחב של בדיקה ניחוחי ותנאים. תוכנת מעקב-אישית בכתב זבוב, שפותחה על ידי אלכס Katsov 19 ומתוחזק כיום על ידי ג&#39;וליאן בראון (המפורטים חומרים), הציג יתרונות נוספים למימושים עדכנית יותר של אולפקטומטר ארבע ברבע 14,20-23. עכשיו זה אפשרי כדי assay עד 100 זבובים בו זמנית מרחבית גבוהה (27.5 פיקסלים / ס&quot;מ) ובזמן (30 פריימים לשנייה) רזולוציה, המאפשר חילוץ פרמטרים שונים, כגון מיקום, מהירות ותאוצה של זבובים בכל נקודת זמן. זה מאפשר חקירות הדינמיקה של תגובות התנהגותיות &quot;הזבובים לריחות 20 </sעד&gt;. יצוין, עם זאת, כי זהותו של זבובים בודדים בתוך האוכלוסייה בתקופת המעקב כולו אינו נשמר. במקום זאת, כל מסלול זבוב נרשם עוד שני מסלולי זבוב לא מצטלבים. בנקודה זו, שירים חדשים מוקצים לאחר הזבובים לסטות. על ידי שילוב תוכנה לכיד וידאו אחר (המפורטים חומרי טבלה), אותה התצורה מאפשרת תקופות מעקב גמישות ויכולה לשמש למעקב אחר זבובים עד 24 שעות על ידי לקיחת תמונות בקצב מסגרת נמוכה. אפשרות זו שמשה ללמוד התנהגויות הטלה של זבובים ולהשוות תנוחות הגוף שלהם עם העדפות ovipositional 14. אולפקטומטר ארבעה השדה עשוי לשמש גם כדי ללמוד תגובות מולטימודליות (למשל חוש ריח וחזותי) גירויים, או לשלב optogenetic 9 או thermogenetic 21 גירוי עם מצגות של גירויים חושיים. יתר על כן, הרזולוציה הגבוהה הזמנית מאפשרת המיצוי של מסלולי FOr כל זבובי פירות בערכת הנתונים האנסמבל. לכן, השיטה מאפשרת חקירת התנהגויות אוכלוסיית הרחה מודרכת גם אינטראקציות חברתיות פרט. הנתונים שנוצרו על ידי assay זה הם חזקים מאוד לשחזור, המאפשרים את השימוש אולפקטומטר ארבעת שדה למסכים התנהגותי. אנו מתארים כאן את הרכבת ההתקנה עבור אולפקטומטר של ארבעה רביעים. בנוסף, אנו מראים את השימוש בו מנסה לאמוד משיכה ההרחה בתגובה חומץ תפוחים ודחייה בתגובה propionate אתיל מרוכז מאוד. לבסוף, אנו מתארים ולספק קוד לדוגמא עבור הניתוח של נתוני מעקב זבוב המוקלטים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Air delivery system&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Tubing and connectors&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermoplastic NPT(F) Manifolds</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>Hex reducing&amp;nbsp; nipple (1/4MNPT-&gt;1/8MNPT)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>Tubing (ID:1/8)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5108K43</td><td>50 Ft</td></tr><tr><td>Tubing (ID:1/16)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>52355K41</td><td>100 Ft</td></tr><tr><td>Barbed tube fittings</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5117K71</td><td>1 pack</td></tr><tr><td>Push-to-connect tube fittings</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/4MNPT-&gt;1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K439</td><td>1 pack (10)</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/8MNPT-&gt;1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K438</td><td>2 pack (10)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/8MNPT-&gt;1/16BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>5463K4</td><td>2 pack (10)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Barbed Tube Fittings (1/4MNPT-&gt;1/4BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>&amp;nbsp; 5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>Hex head plug</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Air pressure regulator, air filter and flowmeters&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Labatory gas drying unit</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA</td><td>Model: L68-NP-303; stock #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>Multitube frames for 150 mm flowtubes</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>Multitube frames for 150 mm flowtubes</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>150 mm flowtubes</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03217-15</td><td>9</td></tr><tr><td>Valve Cartridge</td><td>Cole-Parmer, IL, USA</td><td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>Precision Air regulator</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>Soleniod valves</td><td>Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>Solenoid valve controller</td><td>ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr><tr><td>Electronic flow meter</td><td>Honeywell</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>Odor chambers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)</td></tr><tr><td>Glass odor chamber, 0.25 oz</td><td>Sunburst Bottle</td><td>LB4B</td><td>At least 5 are required per experiment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&quot;In&quot; valve for odor chamber</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>214224PB-0011S000-4074</td><td>1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently</td></tr><tr><td>&quot;Out&quot; valve for odor chamber</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>224214PB-0011S000-4074</td><td>1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently</td></tr><tr><td>O ring</td><td>RT Dygert International, MN, USA</td><td>AS568-029 Buna-N O-R</td><td>1 pack (100)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Fly arena, camera and behavior boxes&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Behavior and camera box material</td><td>Interstate plastics, CA, USA</td><td>ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td><td>1803 sq inch</td></tr><tr><td>Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8&quot; thick, 12&quot; x 12&quot;</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8545K27&amp;nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Glass plates, 1/8&quot; Thick, 9&quot; x 9&quot;</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>8476K191&amp;nbsp;</td><td>2</td></tr><tr><td>Dual action thermoelectric controller</td><td>WAtronix Inc, CA, USA</td><td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>IR LED array</td><td>Advanced Illumination, Rochester, VT, USA</td><td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 LED arrays and one power supply</td></tr><tr><td>Air conditioner Unit</td><td>Melcor Store</td><td>&amp;nbsp;MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Imaging system&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>PEC21211 KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N Interconnect Cable</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>DC-700 Camera Adapter</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>SODC700</td><td>1</td></tr><tr><td>B+W 40,5 093 IR filter</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td><td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer</td><td>Amazon</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>IR Videocamera</td><td>Industrial Vision Source, FL, USA</td><td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)</td><td>1</td></tr><tr><td>USB video converter</td><td>The Imagingsource, NC, USA</td><td>DFG/USB2-It</td><td>1</td></tr><tr><td>iFlySpy2 (fly tracking software)</td><td>Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com</td><td>iFlySpy2</td><td>1</td></tr><tr><td>IC Capture 2.2 software</td><td>The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;(Quantity needed)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dremel rotary tool</td><td>Dremel, Racine, WI, USA</td><td>Dremel 8000-03&amp;nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Diamond-coated drill bits for glass cutting</td><td>Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY</td><td>90606328</td><td>1</td></tr></tbody></table>

olfactory behaviors assayed by computer tracking of drosophila in a four-quadrant olfactometer

אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין כיצד מעגלים עצביים לתפקד להנחות התנהגויות בעלי חיים מתאימות. תסיסנית היא מערכת מודל מצוינת עבור חקירות כאלה בשל ההתנהגויות המורכבות שלה, טכניקות גנטיות חזקות, ומערכת עצבים קומפקטית. מבחני התנהגות מעבדה כבר זמן רב בשימוש עם תסיסנית לדמות תכונות של הסביבה הטבעית לחקור את המנגנונים העצביים שבבסיס את ההתנהלויות (למשל phototaxis, chemotaxis, למידה חושית וזיכרון) 1-3. עם הזמינות האחרונות של אוספים גדולים של קווי תסיסנית מהונדס כי תווית תת עצביים ספציפיים, מבחני התנהגות לקחו על תפקיד בולט לקשר נוירונים עם התנהגויות 4-11. פרדיגמות צדדית לשחזור, יחד עם השגרה חישובית הבסיסית לניתוח נתונים, הן הכרחיות עבור בדיקות מהירות של קווים לטוס מועמד עם genotyp השונהes. שימושי במיוחד הם setups גמישים במספר לחיות ניסוי, משך הניסויים והטבע בגירויים מוצגים. את assay של בחירה צריך גם להפיק נתונים לשחזור כי הוא קל לרכוש ולנתח. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של מערכת ופרוטוקול עבור assaying תגובות התנהגותיות של תסיסנית זבובים בתוך זירת ארבעה שדה גדולה. ההתקנה משמשת כאן assay תגובות של זבובים לגירוי חוש ריח יחיד; עם זאת, אותה התכנית ההתקנה עשויה להיות שונה כדי לבדוק הרחה מרובה, גירויים חזותיים או optogenetic, או שילוב של אלה. התקנת אולפקטומטר מתעדת את הפעילות של אוכלוסיות זבוב להגיב לריחות, ושיטות אנליטיות חישובית מוחלות לכמת התנהגויות זבוב. הנתונים הנאספים מנותחים לקבל לקריאה מתוך מהירה של ריצת ניסיוני, אשר הינה הכרחית עבור איסוף נתונים יעיל אופטימיזציה של תנאי הניסוי.

רשומות assay אולפקטומטר הארבעה ברבע ומנתחות את פעילות הליכת זבובים רבים על פני שטח גדול התנהגותי. יכולים להיות הציגו ניחוחות לתוך הנחלים-האוויר שנכנסים אחת, שתיים, שלוש, או כל ארבעה רביעים. בהעדר ריחות, הזבובים יהיה לנוע בחופשיות בין כל ארבעת הרביעים. התנהגות זו היא קריטית להתבונן כפי שהוא מעיד כי הטיות בלתי מכוונות לא הוכנסו לתוך assay. הטיות אלו יכולים לכלול אור, תנודות הטמפרטורה, ההבדלים זרימת האוויר, או מזהמים ריח. איור 3 ב מציג את תגובות התנהגותיות של אולפקטומטר של ארבעת הרביעים של 25 גברים ו 25 נשים זבובים לייבוש באוויר. זבוב-סינגל מהנתונים שנאספו מודגש גם באיור 3 ב, שהראה כי הזבוב הזה היה לחקור את התנהגותית כולו. הציון במדד המשיכה (AI) עבור כל המסלולים נתחו פני תקופת המבחן של 5 דקות הוא קרוב ל 0, לאינדיקציהng חוסר משיכה ברבע הריח. באופן דומה, מדד אחוז (PI) של הניסוי הוא 0.24, המציין כי זבובים חולקו למדי אפילו בכל ארבעת הרביעים בתקופת מבחן של 5 דקות. התגובה ההתנהגותית ארבעת השדה אל odorant אטרקטיבי מוצגת באיור 3C. חומץ תפוחים הוא הציג לתוך זרם האוויר של &#160; בפינה הימנית העליונה ריח ברבע-זרם האוויר על ידי הצבת דילול 6.25% של חומץ תפוחים לתוך תא ריח הבדיקה. מסלולי הזבוב שנאספו מוצג באפור להפגין שרוב הזבובים לאסוף ברבע ריח זה, וכבר לא לחקור את כל ארבעת הרביעים. מסלול זבוב אחד בצבע מראה שברגע זבוב נכנס חומץ התפוחים ברבע הריח, הוא נוטה להישאר ברבע הריח האטרקטיבי. הבינה המלאכותית של 0.94 עבור הניסוי היא קרובה ל -1 המציין משיכה חזקה odorant זה. הבלש הפרטי של 0.92 עולה כי 92% של הזבובים r<html> emained ברבע ריח במהלך ניתוח התקופה. התגובה ההתנהגותית ארבעה-השדה על odorant דוחה מוצגת באיור 3D. דילול 10% של propionate אתיל odorant להציב בתא ריח שמש כמקור הריח עבור זרם האוויר השמאלי העליון. מסלולי הזבוב התקבצו הניסוי נתח להפגין הימנעות ברבע הריח, המרמז על דחיית ריח מודרך. מסלול זבוב אחד בצבע מראה כי זבוב, כאשר הוא נכנס ברבע הריח, במהירות הסתובב כדי להימנע ברבע הריח. הבינה המלאכותית של -0.68 היא פחות מ 0, אשר מציינת דחייה, והוא קרוב ל -1, מעיד על תגובת odorant דוחה חזקה. הבלש הפרטי של 0.06 עבור הניסוי עולה כי רק 6% (לעומת 25% ~ בניסויי הריח הניטראליים) של נקודות נתוני זבוב במעקב נמצאו ברבע הריח במהלך הניסוי. &quot;1&quot;&gt; מדד משיכה הוא המדד בשימוש הנרחב ביותר לניתוח נתונים ההרחה שכן הוא מאפשר ציונים גדולים מ -0 כדי לציין משיכה (חיובית) ועשרות פחות מ 0 כדי לציין דחייה (שלילי). ככל התוצאה היא +1 או -1, חזק יותר משיכה או דחייה כדי הריח, בהתאמה. כפי שתואר לעיל, מדד זה עשוי לא מצביע בבירור על האחוז או אחוז של זבובים לעקוב אחריהם עד ברבע הריח במהלך הניסוי. ובמקרה זה, מדד היחס יכול להיות אינפורמטיבי יותר. איור 3E דיאגרמות היחסים בין AI ועשרות PI, וכיצד מספרים אלה מתייחסים להתנהגויות דוחה או מושך. את assay ארבעה שדה תוצאת התנהגויות ריח חזקות לשחזור. זה מאפשר השוואות כמותיות בין מלאה תנאי הניסוי כפי שמוצג באיור 3F, וגם מאפשר זיהוי של olfactor עדיןתגובות y שחורגות ניטראלי. כמו כן, מאחר הנתונים מתקבלים ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן, אפשר ללמוד גורמים רבים של תגובות התנהגותיות, כגון מסלולי זבובים יחידים (כפי שמוצג באיור 3), וכן לאפיין דינמיקת פעילות אחרת של הזבובים שדה ריח (למשל, שינויים בכיוון ומהירות 19,20). זה יכול להיות לעיתים קרובות קשה למקם את הזירה ארבע שדה במיקום זהה עבור כל ניסוי, במיוחד מאז ניקוי תכוף של הזירה נדרש. סיפק מנתח סקריפטים לפצות על שינויים קלים אלה על ידי הראשון הולם הנתונים כפי שמוצג באיור 4 א. במקרה זה, את הצורה של זירת הארבעה השדה מחושבת, ונקודות נתונים המצויים מחוץ למרחב זה יוסרו. אובייקטים מעקב אלה לעתים קרובות מייצגים debRIS או השתקפויות כי הם עוקבים בטעות. כשהם לא משקרים בתוך הזירה ובכך מייצגים רעש, חשוב כי נקודות נתונים אלה יוסרו למנוע נתונים שגויים מנתח. בדומה לכך, זה גם חשוב להסיר נקודות נתונים במעקב שעשוי לייצג רעש או שאינו זז זבובים בתוך הזירה. כדי להשיג זאת, תסריט ניתוח מנוצל (ובתנאים כאן) מסיר נקודות נתונים כי למעשה לא זזה (כפי שמוצג באיור 4B). נקודות נתונים אלה הן בדרך כלל במיעוט, עדיין השמירה שלהם תוביל לטעויות בניתוחים. מדד המשיך ועשרות מדד העדפה ניתן לחשב לאחר פרק זמן סביר (לדוגמא בסוף ניסוי 5 דקות כפי שמוצג באיור 3). יצוין, עם זאת, כי מאז זבובים מתבצעים מעקב אחר עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן, ניתוחים דומים יכולים להתבצע לאורך כל הניסוי. זהשמוצג באיור 4C שבו עשרות המשיכו מדד האחוז במדד מחושבים בסלי 10 שניות רציפות על פני תקופת הזמן. ניתוח כזה מאפשר הערכה טובה יותר של שינויי הרחה שעשויה להתרחש לאורך כל הניסוי, כגון הרגלה אל odorant. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig1.jpg" /> איור 1:. סכמטי של אולפקטומטר ארבעה-רביע (א) הגדרת התנהגות מורכבת מערכת המסירה ריח, מערכת בקרת טמפרטורה (לא ניתח), מערכת רכישת התמונה (IR LED אורות מצלמת CCD IR מחובר למחשב), בזירה של ארבעה רביעים ותיבות התנהגות בזירת אור חזקים. העיגולים האדומים לייעד רכיבים המקבילים שמוצגים באיור 2. (ב) תכנון מפורט של מערכת מסירת הריח. הדמויות הירוקות מייצגות את גדלי חיבור / מרה של fittings. צינורות של 1/16 מזהה 1/8 OD מסומנים בצהוב בעוד שאלו של 1/8 מזהה 1/4 OD מסומנים בוורוד. קיצורים: IR, אינפרא אדום; CF, דחיסה Fitting; BF, דוקרני התאמה, MNPT, נושא צנרת זכר הלאומי. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig2.jpg" /> איור 2:. תמונות של התקנת Assay חוש הריח (א) רחב בתחום לאור תיבת מצלמת תיבת התנהגות. (ב) צפה בתוך קופסא ההתנהגות. חללית הטמפרטורה, צינורות מחבר, ומערכי LED IR מסומנים. (C) בזירת ארבעה-רביע. (ד) רחב בתחום לאור מערכת מסירת ריח המחוברים לממיר ההתנהגות. תיבת המצלמה הוסרה כדי לחשוף את מצלמת CCD. (E </strong&gt;) אוויר מרכזי מועבר תחילה דרך ווסת לחץ ולאחר מכן דרך מסנן פחמן. (F) דוגמא של צינורות הריח מחוברים הסעפת. (G) צינורות זרימה ברזולוציה גבוהה להסדיר את זרימת האוויר. (ע) צינורות משלוח ריח ומחברים במורד הזרם של הרגולטורים flowtube. (I) השסתומים סולנואיד להסדיר אם אוויר נקי הוא עבר דרך תא ריח או גורשו אל החדר. (J) תאי הריח מחוברים שסתומים חד כיווניים, ומכילים מיכל זכוכית פנימי עבור odorant. (K) תיבת ההתנהגות מכילה מחוץ Push-To-Connect אבזרים המתחברים צינורות משלוח הריח. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig3.jpg" /> <strאונג&gt; איור 3: נתונים שנוצרו דוגמא באמצעות assay חוש ריח ארבעה-שדה (א) סכמטי של זירת הארבעה-השדה.. (ב) תגובות Neutral הם נצפו כאשר כל ארבעת הרביעים לכלול זלוף אוויר יבש בלבד. (ג) תגובות המשיכו לדילול 6.25% של חומץ תפוחי perfused מהרבע העליונה השמאלית. (ד) התנהגויות דחייה מופעלות על ידי propionate אתיל 10%. באיור 2B-2D, מסלול יחיד מהנתונים רכשו זמם. שיפוע צבע משמש כדי לסמן את מהלך הזמן של הקלטה, עם צבעים כחולים ואדומים להיות ההתחלה והסיום של הקלטות, בהתאמה. (ה) השוואה בין אטרקצית האינדקס (AI) ואת האחוז במדד (PI). (F) ממוצע AI של של 3- 6 ניסויים ללא ריח (בקרה), חומץ תפוחים (ACV) ו -10% אתיל Propionate (EP). ברי שגיאה מצביעים SEM. הבדל סטטיסטי הוערך על ידי קולמוגורוב-סמירנוב test. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig4.jpg" /> איור 4:. דוגמא נתונים שנוצר על ידי צעדי ניתוח הנתונים (א) סינון מרחבים של הנתונים, בביצוע MaskSpatialFiltering.m להסיר נקודות נתונים שנופלות מחוץ לזירה. עיגולים אדומים להראות בעמדות ראשוניות של המעגלים המשמשים להגדרת הגבולות של הזירה. עיגולים שחורים הם העמדות הסופיות, שנרכשו על ידי התאמת המעגל מתארות לנתונים (אפור באזור מוצל בתוך השדה הארבעה). נקודות אדומות וראשי חץ שחור מצביעים נקודות נתונים יוסרו מן הנתונים לאחר שלב הסינון הזה. (ב) סינון זמני של נתונים, בביצוע TemporalFiltering.m. צעד סינון זו מסירה נקודות נתונים שנעים מאוד slowly או בכלל לא, כפי שהם צפויים להיווצר על ידי זבובים שאינו זז או על ידי עפר / השתקפויות מהזירה. נקודה אדומה מוקפת תיבת אדום מקווקו מציין מיקומים של ~ 6,000 נקודות נתונים עם קואורדינטות זהים כי יוסרו אחר צעד סינון זה. (ג) אטרקציה אינדקס (AI) ואחוז אינדקס (PI), מחושב בסלים של 10 שניות ב -5 הדקות האחרונות של ניסוי על ידי AttractionIndex.m. פרופילים זמניים של מדדים אלה מכילים מידע על הדינמיקה של תגובות התנהגותיות עשויים לשמש לניתוח מפורט של התנהגויות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54346/54346fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer at JoVE.com

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

15.6K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Video: Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they yield data relevant to the cognitive processing that occurs under ecologically valid conditions. These two goals often are at odds, since well controlled stimuli often are too repetitive to sustain subjects' motivation. Studies employing electroencephalography (EEG) are often especially sensitive to this dilemma between ecological validity and experimental control: attaining sufficient signal-to-noise in physiological averages demands large numbers of repeated trials within lengthy recording sessions, limiting the subject pool to individuals with the ability and patience to perform a set task over and over again. This constraint severely limits researchers' ability to investigate younger populations as well as clinical populations associated with heightened anxiety or attentional abnormalities. Even adult, non-clinical subjects may not be able to achieve their typical levels of performance or cognitive engagement: an unmotivated subject for whom an experimental task is little more than a chore is not the same, behaviourally, cognitively, or neurally, as a subject who is intrinsically motivated and engaged with the task. A growing body of literature demonstrates that embedding experiments within video games may provide a way between the horns of this dilemma between experimental control and ecological validity. The narrative of a game provides a more realistic context in which tasks occur, enhancing their ecological validity (Chaytor &amp; Schmitter-Edgecombe, 2003). Moreover, this context provides motivation to complete tasks. In our game, subjects perform various missions to collect resources, fend off pirates, intercept communications or facilitate diplomatic relations. In so doing, they also perform an array of cognitive tasks, including a Posner attention-shifting paradigm (Posner, 1980), a go/no-go test of motor inhibition, a psychophysical motion coherence threshold task, the Embedded Figures Test (Witkin, 1950, 1954) and a theory-of-mind (Wimmer &amp; Perner, 1983) task. The game software automatically registers game stimuli and subjects' actions and responses in a log file, and sends event codes to synchronise with physiological data recorders. Thus the game can be combined with physiological measures such as EEG or fMRI, and with moment-to-moment tracking of gaze. Gaze tracking can verify subjects' compliance with behavioural tasks (e.g. fixation) and overt attention to experimental stimuli, and also physiological arousal as reflected in pupil dilation (Bradley et al., 2008). At great enough sampling frequencies, gaze tracking may also help assess covert attention as reflected in microsaccades - eye movements that are too small to foveate a new object, but are as rapid in onset and have the same relationship between angular distance and peak velocity as do saccades that traverse greater distances. The distribution of directions of microsaccades correlates with the (otherwise) covert direction of attention (Hafed &amp; Clark, 2002).

Procedures for recording high-density EEG and gaze data during computer game-based cognitive tasks are described. Using a video game to present cognitive tasks enhances ecological validity without sacrificing experimental control.

משחק מחשב המבוסס על שילוב של ניסויים ההתנהגות עם מעקב צפיפות גבוהה מבט EEG ו אינפרא אדום

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Assessment of Social Interaction Behaviors

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and stability of the networks and relationships that define societies. For animals, such as mice, recognition of conspecifics may be important for maintaining social hierarchy and for mate choice 1.
A variety of neuropsychiatric disorders are characterized by disruptions in social behavior and social recognition, including depression, autism spectrum disorders, bipolar disorders, obsessive-compulsive disorders, and schizophrenia. Studies of humans as well as animal models (e.g., Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus, Rattus norvegicus) have identified genes involved in the regulation of social behavior 2. To assess sociability in animal models, several behavioral tests have been developed (reviewed in 3). Integrative research using animal models and appropriate tests for social behavior may lead to the development of improved treatments for social psychopathologies.
The three-chamber paradigm test known as Crawley's sociability and preference for social novelty protocol has been successfully employed to study social affiliation and social memory in several inbred and mutant mouse lines (e.g. 4-7). The main principle of this test is based on the free choice by a subject mouse to spend time in any of three box's compartments during two experimental sessions, including indirect contact with one or two mice with which it is unfamiliar. To quantitate social tendencies of the experimental mouse, the main tasks are to measure a) the time spent with a novel conspecific and b) preference for a novel vs. a familiar conspecific. Thus, the experimental design of this test allows evaluation of two critical but distinguishable aspects of social behavior, such as social affiliation/motivation, as well as social memory and novelty. "Sociability" in this case is defined as propensity to spend time with another mouse, as compared to time spent alone in an identical but empty chamber 7. "Preference for social novelty" is defined as propensity to spend time with a previously unencountered mouse rather than with a familiar mouse 7. This test provides robust results, which then must be carefully analyzed, interpreted and supported/confirmed by alternative sociability tests. In addition to specific applications, Crawley's sociability test can be included as an important component of general behavioral screen of mutant mice.

Here we describe a detailed protocol for examination of sociability in mice by using Crawley's sociability and preference for social novelty test. We describe the advantages and possible applications for this procedure, including critical details important for correct interpretation of the results.

הערכת התנהגויות אינטראקציה חברתית

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biology

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

ראייה ריח מעקב מתווכת במהלך טיסה ב תסיסנית

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב<em&gt; דרוזופילה</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, mechanoreception, hearing, and chemoperception through taste, via direct contact or through olfaction, which represents the response to a volatile molecule acting at longer range. Volatile chemical molecules are very important signals for most animals in the detection of danger, a source of food, or to communicate between individuals. Drosophila melanogaster is one of the most common biological models for scientists to explore the cellular and molecular basis of olfaction. In order to highlight olfactory abilities of this small insect, we describe a modified choice protocol based on the Y-maze test classically used with mice. Data obtained with Y-mazes give valuable information to better understand how animals deal with their perpetually changing environment. We introduce a step-by-step protocol to study the impact of odorants on fly exploratory response using this Y-maze assay.

Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay

We present a choice test to reveal the influence of odorants on Drosophila behavior using a Y-maze assay.

בדיקה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Olfaction עם Assay Y-מבוך

Detecting signals from the environment is essential for animals to ensure their survival. To this aim, they use environmental cues such as vision, ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Four-Way Olfactometer Assay: A Method to Assess Odorant-Cued Responses in Drosophila

Source: Lin, C.C., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54346/" target="_blank">Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer</a>. J. Vis. Exp. (2016).
Fruit flies have a complex olfactory system, can discriminate hundreds of odorants, and use their sense of smell to direct behavioral decisions. This video describes the four-way olfactometer assay, a method to study olfactory behavioral responses in flies. The featured protocol clip shows how to handle test flies and what are critical steps while performing the assay.

בדיקת אולפקטומטר ארבע-כיוונית: שיטה להערכת תגובות מרומזות ריח בדרוזופילה

Source: Lin, C.C., et al. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (2016).
Fruit flies ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Adult

Drosophila Y-maze Assay: A Method to Assess Olfactory Responses in Flies

Source: Simonnet, M. M., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/51241/" target="_blank">Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay</a>. J. Vis. Exp. (2014).
This video describes a method to test olfactory exploratory behavior in the fruit fly, called the Y-maze. The featured protocol clip demonstrates how to set up and conduct the assay.

דרוזופילה Y-maze Assay: שיטה להערכת תגובות חוש הריח בזבובים

Source: Simonnet, M. M., et al. Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay. J. Vis. Exp. (2014).
This video describes a method to test olfactory ...

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video