We thank the Clinical Microbiology Service staff of the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center for help in collecting clinical specimens. This study was supported in part by a research agreement between MSKCC and Alere Scarborough (SK2013-0262).

מסר אתיקה: שימוש שמאל מעל דגימות קליניות יאושר והוא פועל בהתאם להנחיות של דירקטוריון הסקירה המוסדי במרכז לחקר סרטן קטרינג סלואן הזיכרון. 1. לפני הפעלת Assay הערה: השפעת A ו- B assay מאושר דגימות ספוגית אף ולוע ועבור מטליות אף ולוע מאוחסנות תקשורת תחבורת ויראלי. מטליות כלולות בערכה ויש להשתמש בם עבור ביצועים אופטימליים. עם זאת, זהורית, קצף, נהר מטליות או ספוגיות אף פוליאסטר יכולות לשמש גם כדי לאסוף דגימות ספוגית אף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף דגימת אף ספוגית, הכנס את הספוגית לתוך הנחיר כי יש ניקוז הבולט ביותר או כי הוא הכי צפוף. עם סיבוב עדין, לדחוף את הספוגית לתוך הנחיר עד ההתנגדות הוא פגשה לסובב מספר פעמים כנגד קיר האף לפני ההסרה לאט מהנחיר. אחסן את מטליות ו להסיעם בקבוקונים המכילים 3 מ&quot;ל של התקשורת התחבורה ויראלי (VTM). הערה: תשומת לב קפדנית approprאוסף הדגימה iate חייב להתפרש אוסף הדגימה לקוי עשוי להניב תוצאות שגויות. הערה: דגימות ספוגיות צריכים להיבדק בהקדם האפשרי לאחר איסוף. עם זאת, הם עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך עד שעה 2 או בקירור ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות אם בדיקות אינן זמינות מייד. טרי דגימות שנאספו הם אידיאליים עבור ביצועים במבחן אופטימליים. טיפול מדגם לא נכון, אחסון, ו / או הובלה עשוי להניב תוצאות שגויות. הערה: כאמצעי זהירות, אנשי ביצוע בדיקה זו צריכים להתייחס לכל הדגימות בפוטנציה זיהומיות שמירה על הנחיות בטיחות אוניברסלית בעת טיפול דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו כל הדגימות לטמפרטורת החדר לפני הבדיקה. הערה: כל מרכיבי הבדיקה מיועדים לשימוש יחיד בלבד ולא אמור לשמש לביצוע בדיקות מרובות. אין לערבב מרכיבי ערכת ממספרים הרבה שונים. אין להשתמש ריאגנטים ערכה מעבר לתאריך התפוגה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את מקלט המדגם הכחול Rooטמפרטורה מ לפני הבדיקה. בסיס המבחן הכתום ניתן לבדוק ללא הצורך לחמם לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את כל פיסות הבדיקה בתוך האריזה רדיד עד מיד לפני השימוש. הפעל את המכשיר על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בצד של המכשיר. הזן את מזהה המשתמש ולחץ על &#39;אישור&#39;. </li></ol> 2. הרצת מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בתהליך הבדיקה, לגעת &#39;הפעלה נסיונית &quot;במסך המכשיר. הזן את מזהה המטופל באמצעות המקלדת שעל המסך או סורק ברקוד ולחץ על &#39;אישור&#39;. פתח את המכסה והכנס את בסיס מבחן אורנג לתוך מחזיק בסיס מבחן אורנג &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר שהמבחן הנכון מוצג על המסך ולחץ על &#39;אישור&#39;. הכנס את מקלט המדגם הכחול לתוך החזיק מקלט מדגם הכחול. הערה: אין לפתוח את השפופרת מדגם לפני הצבת המכשיר זה ימנע למאגר elution מלהגיע טמפרטורת ההפעלה הנכונה ועלול להשפיע על הביצועים במבחן. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו מקלט מדגם להתחמם. כאשר תתבקש על ידי המכשיר, להסיר את החותם בנייר כסף ומניחים ספוגית החולה להיבדק לתוך השפופרת המדגם. הערה: בעת הסרת הרדיד, הנח שתי אצבעות על שפת הכונס לדוגמא כדי לוודא שהוא נשאר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לערבב את הספוגית בנוזל במשך 10 שניות, לחיצה על הראש הספוגי כנגד צד המקבל מדגם כפי שאתה לערבב אותו כדי לעזור לסלק את הדגימה מן הספוגית. &#39;אישור&#39; לחץ כדי להמשיך. אם מטליות בדיקות מאוחסנות במדיום תחבורת ויראלי, מערבולת VTM במשך 10 שניות ולאחר מכן להוסיף 200 μl למקלט המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על מחסנית ההעברה הלבנה לתוך שפופרת המדגם הכחולה. המשך ללחוץ על המקלט מדגם עד שהחיווי הכתום עולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם ולאחר מכן חבר את מחסנית ההעברה לבסיס הבדיקה. שים את המחוון הכתום יורד פעם העברה המחסנית מחוברת כהלכה. לסגור את המכסה ואל תפתח עד &quot;מבחן השלם&quot;מופיעה הודעה על המסך. </li></ol> 3. בקרת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת &#39;הפעלה QC Test&#39; במסך הבית. בחר את פעולת QC שיופעל. אשר את סוג הבדיקה כדי להתאים מדגם QC שנועד לבדיקה על ידי נגיעה על &#39;אישור&#39; ובעקבות על מסך כדי להשלים בדיקות. </li></ol> 4. פרשנות תוצאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ריצת השלמת הבדיקה, לבחון את תוצאות הבדיקה המוצגת על המסך עם פרשנויות לנוכחות של השפעת A, B, תת ידוע. לקבלת תוצאות חוקיות לחזור על הבדיקה. </li></ol> תחזוקה וניקיון 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את המכשיר באזור הספסל שמסביב יומי עם אתנול 70% או פתרון אקונומיקה 10%. תרסיס לניקוי על מטלית לחה, נטול סיבים לניקוי. אין לשפוך הפתרונות ישירות על המכשיר. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , 1-43 (2013).</li><li>Poehling, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Underrecognized+Burden+of+Influenza+in+Young+Children.">The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children.</a> New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+Deaths+Associated+with+Seasonal+Influenza+---+United+States,+1976-2007.">Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).</li><li>Agrawal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+real-time+PCR+and+conventional+RT-PCR+during+a+2+year+surveillance+for+influenza+and+respiratory+syncytial+virus+among+children+with+acute+respiratory+infections+in+Kolkata,+India,+reveals+a+distinct+seasonality+of+infection.">Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection.</a> Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).</li><li>Ginocchio, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+Weaknesses+of+FDA-Approved/Cleared+Diagnostic+Devices+for+the+Molecular+Detection+of+Respiratory+Pathogens.">Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens.</a> Clinical Infectious Diseases. 52, 312-325 (2011).</li><li>Grohskopf, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+control+of+seasonal+influenza+with+vaccines:+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices-United+States,+2013-2014.">Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014.</a> MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).</li><li>Molinari, N. -. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+annual+impact+of+seasonal+influenza+in+the+US:+measuring+disease+burden+and+costs.">The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs.</a> Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).</li><li>Aoki, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+administration+of+oral+oseltamivir+increases+the+benefits+of+influenza+treatment.">Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).</li><li>Noyola, D. E., Demmler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+rapid+diagnosis+on+management+of+influenza+A+infections.">Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections.</a> The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).</li><li>Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EFfect+of+rapid+diagnosis+of+influenza+virus+type+a+on+the+emergency+department+management+of+febrile+infants+and+toddlers.">EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers.</a> Archives of Pediatrics &amp; Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).</li><li>Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+and+clinical+sensitivity+of+the+3M+rapid+detection+influenza+A+B+assay.">Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay.</a> J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).</li><li>van Doorn, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+validation+of+a+point-of-care+multiplexed+in+vitro+immunoassay+using+monoclonal+antibodies+(the+MSD+influenza+test)+in+four+hospitals+in+Vietnam.">Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam.</a> J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).</li><li>Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+six+influenza+rapid+tests+in+detecting+human+influenza+in+clinical+specimens.">Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).</li><li>Fiore, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+agents+for+the+treatment+and+chemoprophylaxis+of+influenza+---+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices+(ACIP).">Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP).</a> MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).</li><li>Harper, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+influenza+in+adults+and+children--diagnosis,+treatment,+chemoprophylaxis,+and+institutional+outbreak+management:+clinical+practice+guidelines+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America.</a> Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).</li><li>Hannoun, C., Tumova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+influenza+laboratory+diagnostic+and+surveillance+methods+in+Europe.">Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe.</a> European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).</li><li>Leonardi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+2009+H1N1+influenza+A+virus+using+fluorescent+antibody+methods.">Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods.</a> Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).</li><li>Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+Rapid+Influenza+Diagnostic+TestsA+Meta-analysis.">Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).</li><li>Lee, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+rapid+diagnostic+test,+NanoSign(R)+Influenza+A/B+Antigen,+for+detection+of+the+2009+pandemic+influenza+A/H1N1+viruses.">Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses.</a> Virol J. 7, 244 (2010).</li><li>Tang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+accuracy+of+a+PLEX-ID+flu+device+for+simultaneous+detection+and+identification+of+influenza+viruses+A+and+B.">Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B.</a> J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).</li><li>Bandt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+high-throughput-identification+of+influenza+A+subtypes+from+clinical+specimens+with+a+DNA-oligonucleotide+microarray+in+an+outbreak+situation.">Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).</li><li>Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Idaho+Technology+FilmArray+system+to+real-time+PCR+for+detection+of+respiratory+pathogens+in+children.">Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children.</a> J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).</li><li>Teo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VereFlu&#8482;:+an+integrated+multiplex+RT-PCR+and+microarray+assay+for+rapid+detection+and+identification+of+human+influenza+A+and+B+viruses+using+lab-on-chip+technology.">VereFlu&#8482;: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology.</a> Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).</li><li>Babady, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Luminex+xTAG+RVP+Fast+assay+and+the+Idaho+Technology+FilmArray+RP+assay+for+detection+of+respiratory+viruses+in+pediatric+patients+at+a+cancer+hospital.">Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital.</a> J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).</li><li>Chidlow, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplex+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assays+for+rapid+detection+and+identification+of+pandemic+(H1N1)+2009+and+seasonal+influenza+A/H1,+A/H3,+and+B+viruses.">Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses.</a> J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).</li><li>Bell, J. J., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Alere+I+influenza+A&amp;B+nucleic+acid+amplification+test+by+use+of+respiratory+specimens+collected+in+viral+transport+medium.">Evaluation of the Alere I influenza A&amp;B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium.</a> J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).</li><li>Nie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Alere+i+Influenza+A&amp;B+for+Rapid+Detection+of+Influenza+Viruses+A+and+B.">Evaluation of Alere i Influenza A&amp;B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).</li><li>Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+the+Molecular+Alere+i+Influenza+A&amp;B+Test+Compared+to+That+of+the+Xpert+Flu+A/B+Assay.">Performance of the Molecular Alere i Influenza A&amp;B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> נגיפי שפעת גורמים משמעותיים עולמי של תחלואה ותמותה. אבחון מהיר ומדויק של שפעת הוא אחד המפתחות העיקריים לניהול התפרצויות שפעת בעונת נשימה. בדיקות אחרות מבוסס אנטיגן הן מהירות וקלות לביצוע; עם זאת, יש להם רגישויות נמוכות 13. מצד השני, בדיקות מולקולריות מסורתיות השתפרו רגישות, אך דורשות אנשי טכנולוגית מעבדה מנוסות יותר לבצע והם יקרים יותר. שפעת A ו- B assay המתואר במחקר זה ופרוטוקול הוא CLIA-וייתר, בדיקה מולקולרית מהירה לשפעת A ו- B. הטכנולוגיה מבוססת על הגברה-בידוד תרמי לאיתור וההבחנה של נגיפי שפעת A ו- B. אנחנו מראים תוצאות נציג כדי להדגים את הביצועים של שפעת A ו- B assay בפנל של לארכיון, דגימות קפואות NPS VTM הוערכה לעומת אחר assay לוח מולקולרי מבוסס נשימה. &gt; הדגימות שנקבעו להיות &quot;חד-משמעית&quot; או &quot;untypeable&quot; על-פי מבחן RP היתה הרגישות הנמוכה ביותר על ידי שפעת ו assay B. בנוסף, תוצאות צורמות נצפו בתדירות גבוהה יותר עבור דגימות עם ערכי C T גבוהים מבחני RP, הדבר המצביעה על כך שיעור זיהוי הנמוך ידי assay היה קשור titers ויראלי הנמוך. את assay היה ביצועים משופרים לצורך זיהוי על B נגיף השפעת על וירוס שפעת A זיהוי עם רגישות 90.2% וסגוליות 98.1%. התוצאות כאן עולות בקנה אחד עם ספרות שפורסמה בעבר 26, 27, 28. למחקר זה יש שתי מגבלות חשובות. ראשית, דגימות אוחסנו VTM לבדיקה על הרציף. עם זאת, בעת הדגימות נבדקו, הפלטפורמה לא היה אישור FDA עבור סוג מדגם זה. לכן, הדילול לתוך VTM, עשוי צמצםזיהוי של דגימות VTM נמוכה כייל. שנית, הדגימות שנבדקו עם השפעת ו assay B אוחסנו ב -70 מעלות צלזיוס במשך 6 עד 9 חודשים לפני בדיקה ואילו בדיקות RP נעשה על דגימות טריות מייד לאחר קבלתן. יתכן כי הקפאת דגימות נוספות מופחת זיהוי שפעת בדגימות. שפעת A &amp; B יש assay כמה צעדים הוא פשוט לביצוע. עם זאת, ישנם שני שלבים עיקריים שיש להשלימן כראוי וכי משתמשים יכולים לפתור אם הם חווים שגיאות. ראשית, בהגדרה ראשונית של assay, מחסנית ההעברה חייבת להיות מחוברת לבסיס הבדיקה עד שהם לוחצים למקומו. אם שני חלקים אלה אינם מובטחים כראוי, בטווח ייכשל ויהיה צורך לחזור מההתחלה. שנית, המכשיר צריך להתחמם במשך 2 דקות לפני הוספת המדגם. לאחר זמן להתחמם זה, יש משתמשים 30 שניות להוסיף המדגם, לחבר את ג ההעברהartridge לבסיס הבדיקה, ולסגור את המכסה. אם הזמן עובר לפני שלב זה הושלם, המכשיר ייכשל בטווח ואת המדגם להגדיר יצטרך לחזור מההתחלה. המגבלות של assay כוללות עלייה קלה הידיים על זמן ורגישות נמוכה יותר בהשוואה ללוח הנשימה ואינו תת סוג א שפעת יתר על כן, סוגים הדגימה היחיד שיכול לשמש עם assay הם מטליות האף והלוע או NPS המאוחסנים תקשורת תחבורת ויראלי; הביצועים של assay עבור כל סוג דגימה אחר, כגון דגימות נשימה תחתונות, לא הוערכו. חשוב לציין כי כל הצעדים בפרוטוקול זה הם קריטיים. כל שינוי או סטייה מן הפרוטוקול כפי שנכתב ועלול לגרום לביצועים נמוכים או של assay וחייב להיות מוערך על ידי המשתמש. היתרון של הטכנולוגיה הוא כי יש המכשיר טביעת רגל קטנה, רק לוקח 15 דקות כדי לבצע, למרות שהטכנולוגיהמבוסס על שיטות מולקולריות, אינו דורש הכשרה או כישורים מיוחדים כדי לבצע. שפעת A ו- B assay העריכו במחקר זה יש פוטנציאל לשמש כחלופה RIDTs לאבחון של שפעת. המערכת יש את היתרון של זמן בדיקה כולל קצר, יש טביעת רגל קטנה והוא קל לשימוש. בסך הכל, את העיצוב של המכשיר הוא מתאים בדיקות צבע של טיפול.

נגיף שפעת לגרום כמות משמעותית של תחלואה ותמותה מדי שנה 1, 2, 3. שפעת מסובכת מאופיינת בתסמינים חוקתיים נשימה כגון חום, כאבי שרירים, כאבי ראש, ואת לא פרודוקטיביים שיעול 4, 5. מבוגרים יחידים, ילדים צעירים, בחולים מדוכאי חיסון, וחולים עם מחלות רקע שבבסיס נמצאים בסיכון גבוה יותר לסיבוכים רציניים כמו דלקת ריאות, דלקת שריר הלב, מחלת מערכת העצבים המרכזית, או מוות 6, 7. זיהום שפעת הוא ייחודי מפני וירוסים נשימה אחרים כי הממשל הפקודה של טיפול אנטי-ויראלי בתוך 48 שעות מהופעת התסמינים יכולים להפחית את חומרת המחלה, אורך 8. זיהוי מהיר של שפעת כבר גםמפחית את השימוש באנטיביוטיקה מיותרת 9, 10. יתר על כן, חולים מאושפזים עם זיהומי שפעת יש להציב בחדרים מבודדים עם אמצעי זהירות בקרת הזיהום מתאים. עם זאת, מחלות בדרכי נשימה הנגרמות על ידי וירוסים שאינם שפעת יכולות להיות קשות קליני להבחין משפעת. מסיבה זו, בדיקות אבחון מהירות ומדויקות לשפעת חשובה מאוד לניהול מטופל קליני. מבחנים קיימים מספר לאיתור וזיהוי של נגיפי שפעת. בדיקות לגילוי מהיר אנטיגן שפעת (RIDTs) נמצאים בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית כבדיקות Point-of-care כי הם פשוט לשימוש לספק תוצאות תוך 15 עד 30 דקות 11, 12; עם זאת, הרגישויות שלהם להשתנות משמעותית (10-80%) בהתאם ליצרן ואת האוכלוסייה נבדקת, ואת סוג שפעת subty13 PE, 14, 15. מבחני קרינה ישירים (DFAs) לספק רגישויות מעולות על RIDTs, אבל הפעם העיבוד גדול (~ 3 שעות) וחייב להסתיים עד וטכנולוגים מיומנים 16, 17. תרבות ויראלי כבר את תקן הזהב לאבחון שפעת ושיפרה רגישות מעל שניהם RIDTs ו DFAs 18. עם זאת, תרבות ויראלי שפעת יכול לקחת בין 2-14 ד להשלים, הולכת ופוחתת השירות שלה בסיוע וניהול החולה 19. לבסוף, בדיקות הגברת חומצות גרעין (NAAT) החליפו טכניקות תרבות כתקן הזהב החדש באבחון שפעת. NAAT נחשבת כבעלות רגישות הגדולה לאיתור שפעת בעוד כמה שעות. עם זאת, NAAT הם המבחנים היקרים ביותר ודורש ציוד וטכנולוגים מיוחדים כדי לבצע 5 <sעד&gt;, 20, 21, 22, 23, 24, 25. שפעת assay A ו- B המתואר כאן הוא מבחן השפעת המהיר המולקולרי CLIA-וייתר הראשון שכבר זמין. assay זה עובד על ידי העסקת תגובת הגברה שסחב Endonuclease (NEAR) המשתמשת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. assay זה מבדיל שפעת A מ- B, דורש 2 דקות כדי להגדיר ולעבד דגימה אחת, ודורש בסך הכל 15 דקות כדי להשלים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור assay שפעת A &amp; B. בנוסף, אנו מספקים נתונים לדוגמה להגדיר השוואת הביצועים של שפעת A ו- B assay על ספוגית האף והלוע בארכיון (NPS) דוגמאות טיפוסיות מאוחסן במדיום התחבורה ויראלי (VTM) למשנהו assay לוח הפתוגן הנשימה.

<table><tbody><tr><td>Alere i Instrument</td><td>Alere</td><td>NAT-000 (Global), NAT-024 (US)</td><td></td></tr><tr><td>Alere i Influenza A &amp;amp; B 24 Test Kit</td><td>Alere</td><td>425-000 (Global), 425-024 (US)</td><td></td></tr><tr><td>Alere i Barcode Scanner</td><td>Alere</td><td>EQ001001</td><td></td></tr><tr><td>Alere Universal Printer</td><td>Alere</td><td>55115 (Global), alereiprinter&amp;nbsp;(US)</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l precision pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l disposable pipette tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viral transport medium</td><td>Remel</td><td>M4-RT</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid molecular detection and differentiation of influenza viruses a and b

שפעת היא מחלה נשימתית מדבקת הנגרמת על ידי נגיפי שפעת A ו- B בבני אדם וגורמת כמות משמעותית של תחלואה ותמותה מדי שנה. שפעת A ו- B assay היה מבחן השפעת מהירה מולקולרית CLIA-ויתרו הזמין הראשון. שפעת A ו- B הבדיקה פועלת על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. הנה, את הביצועים של השפעת A ו- B assay על קפוא, בארכיון ספוגית אף ולוע (NPS) דגימות מאוחסנות במדיום תחבורת ויראלי (VTM) הושוו assay לוח נשימה. המופע של assay שפעת A ו- B הוערך על ידי השוואת התוצאות למודל התייחסות לוח הנשימה. רגישות וירוס הכולל שפעת הייתה 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) ואת סגוליות 86.9% (CI, 71.0-100). עבור בדיקות B נגיף השפעת, הרגישות והסגוליות עמדו 90.2% (CI, 68.5-100) ו 98.8% (CI, 68.5-100), בהתאמה. מערכת זו יש את היתרון של זמן בדיקה קצר משמעותי מאשר כל assay מולקולרית אחרת קיימים, ואת ההליך פשוט, ללא פיפטה פועלת על משולבים במלואם, סגור, מערכת-טביעת רגל קטנה. בסך הכל, שפעת A ו- B assay העריכו במחקר זה יש פוטנציאל לשמש כמבחן אבחון שפעת מהירה בנקודת הטיפול.

במחקר זה, בארכיון דגימות NPS נאספו מאושפזים עם הצגת תסמינים דמויי שפעת במרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג (MSKCC) במהלך התפרצות שפעת בין 15 בדצמבר, 2012 ו -1 במארס 2013. דגימות NPS הוגשו 3 מ&quot;ל של VTM ונבדק כחלק בפועל קליני שגרתי עם assay מולקולרי שמזהה פאנל של וירוסים בדרכי הנשימה (RP), כולל שפעת A, A-1, A-3, ו- B. במהלך תקופת המחקר, 3,675 דגימות NPS הוגשו למעבדה הקלינית MSKCC לבדיקה. דגימות אלה, 45, 425, 37, ו -77 נדבקו בשפעת וירוסי A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), ו- B, בהתאמה עם RP. סך של 360 דגימות חיוביות, 40 דגימות מכל אחת תת השפעת, ו -37 Au. בנוסף, 1-2 דגימות שליליות שהגיעו למעבדה מיד לפני או אחרי כל אחת מהדגימות החיוביות נבחרו testi עוקבותng עם שפעת A ו- B assay. בסך הכל, השפעת A ו- B assay זוהו 79 וירוס שפעת, 37 B נגיף שפעת, 240 שליליים, ו -4 תוצאות לא חוקיות (כישלון של בקרות פנימיות) (טבלה 1). היו 46 תוצאות סותרות עם 44 דגימות חיוביות על RP רק ושנייה חיובית על השפעת ו assay ב &#39;בלבד. Assay שפעת מולקולרית מבוססת השלישי בוצעה על 44 הדגימות הצורמות אשר זוהו 33/43 (וירוס 8 שפעת, 21 Au, ו- B וירוס 2 שפעת) כי היו חיוביים על ידי RP ו 0/1 חיובי (וירוס שפעת) על ידי assay A ו- B שפעת. הסכם בין שניים או יותר מבחני נחשב זיהוי מדויק. רגישות assay הכוללת שפעת A ו- B עבור וירוס הכולל שפעת הייתה 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5). הרגישות עבור תת שפעת A הוא A-1, 84.6% (CI, 58.5-100), A-<html> 3, 90.2% (CI, 62.8-100), ו- Au, 21.9% (CI, 19.6-24.1). סגוליות הכוללת עבור וירוס שפעת A היה 86.9% (CI, 71.0-100). עבור בדיקות B נגיף השפעת, הרגישות והסגוליות עמדו 90.2% (CI, 68.5-100) ו 98.8% (CI, 68.5-100), בהתאמה. בסך הכל, את ערכי CT הממוצעים דגימות עם תוצאות צורמות היו גבוהים באופן משמעותי מאלה שהושגו עבור תוצאות תואמות (16.4 ± 0.48 לעומת 25.7 ± 0.51; p&gt; 0.000) (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54312/54312fig1.jpg" /> איור 1: ערכי CT ממוצעים נקבעו על ידי assay RP עבור דגימות שהיו חיוביים ושליליים, בהתאמה ידי assay עבור כל תת-סוג שפעת. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001.1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54312/54312table1.jpg" /> טבלה 1: ביצועים של שפעת A &amp; B על VTM דוגמאות טיפוסיות בהשוואה לתוצאות התייחסות.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B at JoVE.com

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

אנו מתארים assay מהיר, מולקולרי מבוסס השפעת A ו- B. שפעת assay מזהה כל מטרה בתוך 15 דקות על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. שפעת A ו- B assay הוא ידידותי למשתמש ונזקק ידות על מינימאליות זמן לבצע.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

rapid-molecular-detection-differentiation-influenza-viruses

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center.  אנו מתארים assay מהיר, מולקולרי מבוסס השפעת A ו- B. שפעת assay מזהה כל מטרה בתוך 15 דקות על ידי העסקת הגברת בידוד תרמית עם פריימרים ספציפי שפעת ואחריו איתור יעד עם בדיקות משואה מולקולריות. שפעת A ו- B assay הוא ידידותי למשתמש ונזקק ידות על מינימאליות זמן...

Video: Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5 For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus have been demonstrated.6-11 The identification and subtyping of influenza on DNA microarrays has applications in both public health and the clinic for early detection, rapid intervention, and minimizing the impact of an influenza pandemic. Traditional fluorescence is currently the most commonly used microarray detection method. However, as microarray technology progresses towards clinical use,1 replacing expensive instrumentation with low cost detection technology exhibiting similar performance characteristics to fluorescence will make microarray assays more attractive and cost-effective.
The ampliPHOX colorimetric detection technology is intended for research applications, and has a limit of detection within one order of magnitude of traditional fluorescence11, with a main advantage being an approximate ten-fold lower instrument cost compared to the confocal microarray scanners required for fluorescence microarray detection. Another advantage is the compact size of the instrument which allows for portability and flexibility, unlike traditional fluorescence instruments. Because the polymerization technology is not as inherently linear as fluorescence detection, however, it is best suited for lower density microarray applications in which a yes/no answer for the presence of a certain sequence is desired, such as for pathogen detection arrays. Currently the maximum spot density compatible with ampliPHOX detection is &tilde;1800 spots/array. Because of the spot density limitations, higher density microarrays are not suitable for ampliPHOX detection.
Here, we present ampliPHOX colorimetric detection technology as a method of signal amplification on a low density microarray developed for the detection and characterization of influenza viruses (FluChip). Although this protocol uses the FluChip (a DNA microarray) as one specific application of ampliPHOX detection, any microarray incorporating biotinylated target can be labeled and detected in a similar manner. The microarray design and biotinylation of the target to be captured are the responsibility of the user. Once the biotinylated target has been captured on the array, ampliPHOX detection can be performed by first tagging the array with a streptavidin-label conjugate (ampliTAG). Upon light exposure using the ampliPHOX Reader instrument, polymerization of a monomer solution (ampliPHY) occurs only in regions containing ampliTAG-labeled targets. The polymer formed can be subsequently stained with a non-toxic solution to improve visual contrast, followed by imaging and analysis using a simple software package (ampliVIEW). The entire FluChip assay from un-extracted sample to result can be performed in about 6 hours, and the ampliPHOX detection steps described above can be completed in about 30 min.

ampliPHOX colorimetric detection technology is presented as an inexpensive alternative to fluorescence detection for microarrays. Based on photopolymerization, ampliPHOX produces solid polymer spots visible to the naked eye in just a few minutes. Results are then imaged and automatically interpreted with a simple yet powerful software package.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Bioengineering

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of A. baumannii is crucial for prompt treatment, effective infection control, and curbing antibiotic resistance. However, there is no suitable method for rapid and easy on-site detection of A. baumannii. The DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system offers a rapid, precise, and sensitive approach to A. baumannii detection by integrating the target-specific recognition capabilities of Cas12a with the isothermal amplification efficiency of Recombinase Polymerase Amplification (RPA). This protocol details the detection of A. baumannii using RPA combined with LbaCas12a endonuclease. The following steps are described in this article: extraction of DNA, selection of a specific DNA sequence, design of primer and CRISPR RNA (crRNA), construction of positive recombinant plasmid, setup of Cas12a-RPA assay, optimization of the RPA amplification system, visualization of the RPA-CRISPR/Cas12a assay using a fluorescence detection tool such as a real-time PCR instrument, and evaluation of sensitivity and specificity evaluation.

To facilitate the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii, we present a protocol that employs Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in conjunction with LbaCas12a endonuclease for identifying A. baumannii infections.

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...

בדיקת RT-qPCR מולטיפלקס לזיהוי וירוסים נשימתיים

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

מחבר זרקור: התקדמות בזיהוי מולטיפלקס של וירוסים נשימתיים 

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

פיתוח מבחני RT-qPCR בזמן אמת לזיהוי SARS-CoV-2, שפעת A/B ו-MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...