תודה מיוחדת לד&quot;ר קלייר מ ווטרמן עבור חונכות ודיונים, מישל ביירד ומייק דוידסון למתן רבים של מבנים cDNA פלורסנט המשמש במחקרים אלה, ועם קתרין אפלגייט Gaudenz Danuser לפיתוח תוכנת ניתוח MT plusTipTracker. עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מענק קא&quot;מ מן הריאות הלאומי ללב ודם (NHLBI) לבין המכון הלאומי לבריאות (NIH). (גרנט: 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

שימוש HUVECs בניסויי מורפולוגיה והגירה. Live- תא הדמיה של דינמיקת צמיחת MT שכותרתו EB3 בתוך HUVECs דורשת תנאי תרבית תאים מתאימים לשחזור כדי למדוד ולהעריך שינויים בצמיחת MT ומורפולוגיה HUVEC, כך שהם יכולים להיות מוקצים אז אל קיו איתות ECM. HUVECs מייצגים מודל מצוין לחקר צורת התא ואת תנועתיות. הם מאוד מקובלים transfection עם cDNAs fluorescently שכותרתו, הם מפגינים מורפולוגיות דרמטיות בתגובה הוא רמזי איתות מסיסים ופיסיים, והם שומרים על היכולת לארגן את עצמם לתוך צינורות כלי דם כאשר ספקו תנאי תרבית תאים מתאימים 65-70. בתרביות תאים ראשוניים, כגון HUVECs, מצריכה טיפול וניטור קפדני של מספר מעבר התא על מנת להבטיח את התאים בריאים וכי הם יתנהגו באופן רגיל בזמן ניסויים. לדוגמא, בעת ביצוע ניסויים חוקרים את cytoskeleטון ו / או מורפולוגיה תא, HUVECs לא אמור לשמש לניסויים מעבר למעבר תרבית תאים עשירית, כפי HUVECs בדרך כלל מתחילה להציג מורפולוגיות לא אחידות סביב המעבר כשנים-עשר עד חמישה-עשר. צפיפות תאים גם רגולטור חשוב לבריאות ושגשוגם HUVEC. חקירות הסתעפות HUVEC (ראה פרוטוקול 10.1-10.4, לעיל) להשתמש תרבויות צפיפות תאים נמוכות יחסית על מנת לספק את תאי מרחב פיזי כדי אינטראקציה עם ECM שלהם להאריך בליטות קנים. לעומת זאת, במחקרי גירת פצע קצה (ראה פרוטוקול 10.5-10.8), HUVECs הוא תרבות בשכבה לפני הפציעה. כפי HUVECs כזה, פצע קצה להציג מורפולוגיה יחסית un קנים, להאריך המובילים בליטות בקצה, ולהציג אינטראקציות תאי תאים עם השכנים המיידיים שלהם כפי שהם נודדים לתוך הפצע. אזהרות ואת היתרונות של Dynamics מעקב MT In Living HUVECs. ספינינג מיקרוסקופיה דיסק היא גישה מצוינתלבחון השערות ניסיוניות הדורשים בהירות התמונה confocal עם הזמן ברזולוציה גבוהה. עם מודול מצלמת הליזר המתאים, גישה מיקרוסקופיה זו רגישה קרינת פליטה נמוכה והוא יכול לסייע photobleaching מופחת לעומת סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשוב לציין, גישה זו גם מתאימה גם עבור בינוני עד הדמית זמן ברזולוציה גבוהה כפי שנדרש להפקה מדידות מקיפות של דינמיקת צמיחת MT בגישת תיוג EB3, במגוון סוגי תאים שונים. בעוד המתודולוגיה EB3 של תיוג גדל MT פלוס קצוות יש יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות של MTS תיוג פלורסנטי, יש לה גם חסרונות ייחודיים. לדוגמא, קיים יחס של מערך MT שאינו צומח באופן פעיל בכל זמן נתון, כולל הוא את האוכלוסייה של MTS פירוק ואוכלוסיית סטאבילה, MTS הלא דינמי 71-74. EB3 לא לתייג שני אלה אוכלוסיות של MTS וולכן התרומה של שתי אוכלוסיות אלה לא יכללו בניתוח נתוני הניסוי. מתודולוגיות אלטרנטיבי לבחינת מערך MT כולו התמקד ביטוי טובולין שכותרתו פלורסנטי, אשר משלב לתוך כל האוכלוסיות של MTS ומאפשר זיהוי של גדל, מתכווץ, ואת סטאבילה MTS. עם זאת, בגלל צפיפות גבוהה יחסית של המערך MT סמוך למרכז התא צמוד למרכז בארגון microtubule (MTOC), תיוג מערך MT כולו יוצר חיסרון בביצוע ניתוח התמונה של הקצוות MT שאינם ליד התא בפריפריה 75-77. ניסויים באמצעות שיתוף תיוג שני צבעים של MTS עם טובולין פלורסנט EB3 פלורסנט בתאים חיים חשפו, איכותית, כי הרוב המכריע של MTS שכותרתו טובולין הם גם שכותרתו EB3 78. בנוסף, לא היתה שיטה יעילה של מעקב אוטומטי של MTS שכותרתו עם טובולין ניאון. משמעות הדבר היא כי אוסף נתוניםtion ומדידות של דינמיקת MT בתאים המבטאים טובולין פלורסנט דורשים מעקב ביד של MTS פרט, תהליך שהוא לשגיאה ומייגעת. כתוצאה מכך, ניתוח חישובית אוטומטי של MTS EB3 שכותרתו הפך המתודולוגיה המועדף למדידת דינמיקת MT כפי שהוא יכול להיות מיושם על ניסויי דינמיקת MT פני סוגי תאים רבים בתוך מגוון רחב של משטרים הניסיונות 35,79. קישור Dynamics צמיחה MT כדי HUVEC מורפולוגיה וההגירה. מנקודת המבט של חוקר cytoskeletal, אחד הסתגלות שימושית מאוד של ניתוח המעקב אוטומטי plusTipTracker היא היכולת למדוד ולהעריך הוא שינויי תא ואזוריים בדינמיקת צמיחת MT. דרישת תא להפוך מקוטב היא תנאי מוקדם הכרחי נדידת תאים כיוונית. כרמזי איתות כזה, מקוטב כבר ידועים עוד גורמי נהיגת מפתח עבור נדידת תאים כיוונית 30,31,51,54,56,80,81 </sup&gt;. לדוגמא, מולקולות מסיסות איתות כגון VEGF לגרום פילמור יקטין וצמיחת MT כלפי קיו VEGF בסוגי תאי אנדותל 2,82-87. בנוסף, בתגובה אינטראקציות פיזי עם ECM (למשל, ציות ממדיות mechanosensing), HUVECs לווסת הדינמיקה MT שלהם על ידי מקומי ויסות מפות כדי לקדם צמיחה MT בתוך מתארך בליטות הקנים, וזה משמש כדי להנחות הגירה HUVEC בכיוון של קיו 5,31,88. לפיכך, קיטוב בתגובה לאותות איתות תאיים מדגיש את הצורך בהערכה ניסיונית של שינויי נקודות בדינמיקת cytoskeletal. Live- תא הדמיה סימולטני של דינמיקת צמיחת MT (בגישת EB3) ואת נדידת תאי HUVEC קשה מאוד לבצע בגלל MTs לגדול על ציר זמן של שניות, תוך שינויים במורפולוגיה תא והגירה כיוונית להתרחש בקנה מידת זמן של שעות. עם זאת הוא לגבי התהליכים הם אינטימי לינקהד. יתר על כן, רציפה, הדמיה מהירה של EB3 שכותרתו fluorescently על ציר הזמן השני מוביל photobleaching של האות EB3. ניסיונות להתגבר על בעיה זו על ידי ביצוע סדרת הדמיה קצרה EB3 (סדרת רכישה 1-2 דקות) כל 30 דקות הצליחו, אבל יכול להיות מושלם רק במספר קטן של ECS כי היה ביטוי אופטימלי של EB3 וכי לא להציג לרעה אפקטים תאורת לייזר חזר 5. גישה חלופית המאפשרת פרשנויות של איך דינמיקת צמיחת MT לתרום שינויים במורפולוגיה תא והגירה היא אזור plusTipTracker של העניין (ROI) כלי 35 (ראה פרוטוקול 6.6). מתודולוגיה זו מאפשרת לצמיחת MT התא כולו עוקבת להיות תת-מחולק לאזורים המוגדרים על ידי משתמש, שממנו מסלולי צמיחת MT אז יכולים להיות מופקים ונותחו. לדוגמה, השוואות של &quot;מסועפת&quot; לעומת אזורים &quot;הלא-קנים&quot; של התא חשפו כי MTS לגדול יותר שלנחות ועוד בהתמדה בתוך אזורים מסועפים לעומת הפריפריה של התאים הלא-קני 5. בשנת HUVECs פצע קצה מקוטב, השוואות של קצה המובילה ונגררת דינמיקת צמיחת MT הקצה גילו כי פירוק MT-induced MCAK מעוכב במיוחד בתוך הקצה המוביל, אבל לא נגרר לקצה. ערכה אזורית מובילים ונגרר דינמיקת צמיחת MT יתרון HUVECs להביע Rac1 ו / או מוטציות זירחון של MCAK עוד עולה כי הפעלת נגרמת Rac1 של אורורה-קינאז ספציפי מקומי מעכב פעילות MCAK בתוך הקצה המוביל לנהוג קיטוב HUVEC והגירה כיוונית 31. לכן, השילוב של מעקב אוטומטי של דינמיקת צמיחת MT וערכה האזורית של דינמיקת צמיחת MT בתוך בליטות קנים ו / או את הקצה המוביל של פצע קצה HUVECs אפשר לנו לקשר דינמיקת צמיחת MT מורפולוגיה וגירת HUVEC. הפרוטוקולים המתוארים הם designeד לספק מתודולוגיה פשוטה מאוד דיר בדרך כלל לתרבות HUVEC וחקירת ניסיוני. עם זאת, חלק ניכר מן פרטי הפרוטוקול הם מורכבים זמן רב, אשר, בתורו, מספק הזדמנות עבור שגיאות או קשיים בניהול המתודולוגיה הניסיון. למרות שזה היה ניסיון לטפל בבעיות פוטנציאליות ברחבי הפרוטוקול, כאן מסופק ולפתור בעיות נוספות, מפורטות של בעיות פוטנציאליות שניתנות פחות נפוצים או מקוצר אחרת כפי שמציין בתוך פרוטוקול המתודולוגיה. הקשורים coverslips ציפוי עם מצעים polyacrylamide (פרוטוקול 2.2), בעיה נפוצה הנשאלת היא האופי המורכב של הפעלת coverslips זכוכית, צימוד polyacrylamide אל הזכוכית, הפעלת polyacrylamide, ולאחר מכן צימוד ECM אל polyacrylamide. אחת במיוחד צעד קשה ובעייתי פוטנציאלי הוא culturing HUVECs על ג&#39;ל פיברונקטין / polyacrylamide הבא חשיפה של פוליהcoverslips מצופה crylamide עד 2 מ&quot;מ sulfo-SANPAH (שלב 2.2.2.6, לעיל). זה קריטי להצלחת culturing HUVECs על מצעים אלה כי sulfo-SANPAH יוסר לחלוטין ממערכת ניסיוני הבאה נטיית ECM. זה יכול להיות מושג בצורה הטובה ביותר על ידי שטיפה עם DDH 2 O ו דוגרים coverslips DDH 2 O על שייקר לילה. אם תאים בתרבית על ECMS polyacrylamide אינם שורדים, או אם הכדאיות הוא פחות מהצפוי, עלה וחזר לשטיפת sulfo-SANPAH לאחר נטיה כדי פיברונקטין (שלב 2.2.2.9) מומלץ פוטנציאל להקל על בעיה זו. קשור לפרוטוקול 3 (transfection cDNA ותרבות HUVEC על coverslip), השפעה גדולה על ההצלחה של הליך electroporation היא הטיפול של HUVECs היא במהלך trypsinization של התאים כדי להסיר אותם מבקבוק הפלסטיק, ובעקבות הסיום את electroporation (שלבים 3.3-3.4, לעיל). זה קריטי כדי אכפתמלא לפקח על HUVECs בעוד טריפסין, ולא יעלה את הזמן הדרוש עבור התאים &quot;עיגול לטובה&quot; על פני השטח של הבקבוק (בדרך כלל 1-2 דקות). זמן מופרז טריפסין הוא הגורם העיקרי למוות HUVEC, אשר בדרך כלל אינה ממומשת עד תאים מצופה על coverslips מצופה פיברונקטין (שלב 3.4) ולאחר מכן מצליחים לצרף המצע. חשיבות דומה, HUVECs (ורוב סוגי תאים ראשוניים) לא מסתדרים היטב כאשר מושעה • לפרקי זמן ממושכים למאגר electroporation. במהלך ניסויים בקנה מידה גדול יותר, למשל, כאשר המשתמש הינו חמש או יותר תנאים המחייבים electroporation, עדיף לשמור על התאים pelleted ב צינורות בודדים (1 צינור לכל transfection) כדי לערבב אותם, אחד-על-א-זמן , למאגר electroporation מיד לפני electroporation. גישה זו מקטינה זמן הדגירה חיץ electroporation והישרדות HUVEC מוגדל. בנוסף, הצלה מיידית בתקשורת התרבות השלמה היא גם crelectroporation הבא itical. עיכובי הצלת דקה אחת או יותר electroporation הבא יכולים לגרום סף המוות מוחלט HUVEC ובכך יש להימנע. assay נדידת תאים קשור (פרוטוקול 9), הטכניקה של culturing HUVECs בצפיפות גבוהה מאוד תלויה שינוי קריטי (כמתואר בשלב 9.2) של המתודולוגיה תרבית תאים המסורתית HUVEC (המתואר פרוטוקול 3) הדורש ייבוש של coverslip מצופה פיברונקטין על מנת לאפשר תרבות HUVEC לתוך שטח קטן מאוד של coverslip. פעמים רבות, אם coverslip לא יבש לחלוטין או אם ציפוי מראש של coverslip עם פיברונקטין (שלבים 2.1 או 2.2) היה לא יעיל, התאים המכילים התקשורת כי מושם על coverslip תאבד מתח הפנים שלה ולהרחיב את הקצוות של coverslip, ובכך להפחית את הצפיפות של תאים על coverslip. שיטה אחת כדי לפתור בעיה זו פוטנציאל היא לשאוב את התקשורת מן coverslip ולאחר מכןמקום coverslip (עדיין בצלחת 35mm שלה) לחלק האחורי של ארון הבטיחות הביולוגי למשך 5-10 דקות. הסתגלות זו יכולה לסייע כדי לאפשר את זרימת האוויר בתוך ארון לסייע בייבוש המנה. אם כל נוזל גלוי נשאר על coverslip לאחר ייבוש באוויר, לשאוב כתמים נוזליים ושוב ולאפשר לאוויר יבש למשך 5-10 דקות נוספות בקבינט בטיחות ביולוגית. חשוב לציין כי אין דרך למנוע זאת בעיה פוטנציאלית לחלוטין, אבל זה הופך להיות פחות בעיה עם תרגול חוזר של הפרוטוקול. זהו גם המלצה לפתרון בעיות אשר בעת הכנת coverslips עבור assay נדידת תאים (או כל assay, בכלל), כדי להכין coverslips נוסף ויש HUVECs נוסף מוכן ללכת במקרה של בעיות לאורך הדרך. עם שיקולים אלה לפתרון בעיות בחשבון, זה חשוב גם להדגיש את התועלת של פרוטוקולים דנו והשלכותיהם במחקר ביולוגיה של התא בעתיד. תחולת אל polyacrהגישה ylamide הוא רחב יריעה, וכוללת לא רק מחקרים דו מימדי ההתקשרות התא ECM (כמתואר לעיל), אלא גם חקירות תלת מימדי 5. יישום זה הוא קריטי להגדלת הבנתנו כיצד HUVECs להסדיר צורת תא והגירה בסביבות פיסיולוגיות אמורים לספק לחוקרי הבנה בסיסית של איך מורפולוגיים שינויים מתואמים עם שינויי cytoskeletal. בעוד הפרוטוקולים המתואר כאן מתמקדים מדידות של דינמיקת צמיחת MT, רוב הפרוטוקולים יכול וצריך להיות מותאם למדידה מספר רב של היבטים למדידה מיקרוסקופית אחרים של אינטראקציות התא-ECM. עם כל כבוד דינמיקת MT, ישנם רבים מפות, כולל לפחות 14 משפחות של kinesins 89, כל אחד עם תפקיד פוטנציאלי בתרומה הקוטבית HUVEC והגירה מכוונת, וכל אחד מהם יכולים להיחקר באמצעות הפרוטוקולים שהוצגו. חקירות עתידיות במקרה בוסימפוני יכוון אירוסי תא ECM ב רגיל לעומת מדינות חולות. פרוטוקולים HUVEC המוצגים כאן הם החלים על חקירות של תהליכים ההומיאוסטטית וסקולרית נורמלי, כמו גם מדינות מחלה כולל מחלות לב, רטינופתיה, גידולים סרטניים וגרורות, עד כמה שם. Conjugating בעליל מצעי ECMS ו polyacrylamide שקופים ציות נוח עם מחקרים מיקרוסקופים יאפשר ללימודי אירוסי התא ECM כך אנגיוגנזה וסקולרית תא האנדותל יכולה להיות במעקב עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. אלו סוגים של גישות ניסיוניות כבר החלו לחשוף הבדלים חשובים בכושר תא האנדותל, קוטביות, הגירה, ואת ההשפעות של פרוטאינים המווסתים תהליכים אלה 5,31,90. מאמצי עתיד צריכים לשאוף לזהות כיצד השילוב של ציות ECM ו- ממדי mechanosensing עשוי לשמש לחלבונים שליטים מקומית כי למקד ולהסדיר דינמיקת cytoskeletal.

אנגיוגנזה מופעלת על ידי רמזי איתות תאיים המקדמים בתאי האנדותל (EC) לקטב, נודדים עם ייחוד כיוונית, ויוצרים כלי דם חדשים ברקמות הדורשים אספקת דם. גורמים תורמים חשבו לנהוג אנגיוגנזה הם אותות מן מטריקס (ECM). בתגובה רמזים פיזיים, ECS להאריך סניפים חדשים עם ייחוד כיוונית להנחות כיווני תנועה במבנה של 1,2 רשת כלי הדם. הארכיטקטורה של מורפולוגיה הסתעפות EC מוגדרת על ידי רגולציה מקומית של שלד תא microtubule (MT) בצורה מתואמת עם הסדרת contractility acto-שרירן 3. על מנת סניפים EC להיווצר, שרירן-II חייב להיות downregulated מקומית, וכתוצאה מכך בליטות קרום מקומי 4. באותו הזמן באותו המקום בתוך התא, דינמיקת צמיחת MT הופכת שונה וכתוצאה מכך צמיחת MT איטית ומתמשכת לקידום ענף אלוןgation ויציבות 5. תקנה cytoskeletal מתואמת זו מאפשרת ECS לקטב המורפולוגיה שלהם כדי להקל על ההגירה כיוונית. ההתפתחות המינית של מורפולוגיה תא מקוטבת דורשת MT המקוטב הרכבה 6. בעת העברת לתאי האפיתל, MTS לגדול לאט במיוחד בהתמדה בחוד החנית של התא 7-9; בעוד בנוירונים, בייזום ההתארכות של אקסונים או דנדריטים דורשים כי MTS הם לא רק בהווה, אלא כי הם דינמיים עוברים תהליכי ההרכבה ופירוק 10-15. בדרך זו, שליטה מקומית של דינמיקת צמיחת MT מקובעת את הארכיטקטורה של התא ומאפשרת שיפוץ מהיר של מורפולוגיה תאים כמו ECS לנווט ECM שלהם. דינמיקת צמיחת MT מוסדרת על ידי משפחות של חלבוני מנוע מולקולריים וחלבונים לא מנועים, כינת חלבונים הקשורים microtubule או microtubule מתנגש חלבונים (להלן Referred כדי כמפות). מפות ניתן להפעיל באופן מקומי או מומת, בדרך כלל באמצעות איתות מפלי יזם בממשק התא ECM 16,17. ברגע פעיל, מפות פונקציה על ידי קשירה של MT ושינוי קינטיקה של הרכבה ופירוק MT; ובכך תפקוד מקומי להסדיר דינמיקת MT כדי לקדם צורת תא קוטבי 18-20. Mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) היא מפה המשפחה Kinesin-13 הנקשרת הקצוות וזוגות MT הידרוליזה ATP כדי פירוק MT 21-23. תפקיד פונקציונלי זה של MCAK ידוע להיות קריטי בתוך 24-28 ציר mitotic, כמו גם במהלך שלבי 29,30. בתוך השלבים ECS, פירוק MT בתיווך MCAK מוסדר על ידי זרחון המושרה אורורה-A המקומי של MCAK בתגובה לפצוע קצה הפעלה מושרה של GTPase Rac1 הקטן. התוצאה של מפל איתות לכך היא עיכוב של MCAK בחוד החנית של ECS, כשהתוצאה היא צמיחה MT מקוטב כלפי leading קצה ופירוק MT-induced MCAK בקצה המאסף של נודדות 31 ECS. מתודולוגיות מסורתית למדידת הדינמיקה צמיחה MT בדרך כלל השתמשו ביד מעקב של טובולין fluorescently שכותרתו או או, ולאחרונה, שכותרתו fluorescently חלבון מחייב MT סוף 1 או 3 (EB1 או EB3, בהתאמה). הגישה טובולין פלורסנט יש את היתרון של תיוג מערך MT כולו. עם זאת, משום שרוב סוגי תאי mitotic לשמור על מערך רדיאלי של MTS במהלך השלבים 8,32,33, MTS ליד centrosome מאוד צפוף, וכתוצאה מכך, מעקב צמיחת MT ופירוק עם טובולין ניאון בדרך כלל מוגבל לציוד ההיקפי אזורים של התא. המגבלות האלה, ניצול של חלבוני EB-שכותרתו fluorescently (EB1 או EB3) כבר הגישה הנפוצה יותר למדידת דינמיקת MT. בגלל EBS רק התווית הפלוס בסיום הגדילה של MTS, הם מופיעים כמו קטנים (1-3 מיקרומטר), ניאון בהיר לבואts, ובכך לספק סמן להבחין בקלות של פילמור MT עם קרינת רקע מוגבלת מאוד 34-37. בעוד העובדה תווית EBS רק קבוצת משנה של מערך MT מייצגת כוח עיקרי של גישת EB, הוא גם ממחיש מגבלה אחת חשובה, כי MTS שאינו צומח לא מסומן על ידי גישת EB3. עם זאת, היכולת למדוד ולעקוב אחר שביטי EB3 לאורך זמן וכדי להמחיש צמיחת MT בתוך האזורים הסלולר תת לעשות אידיאלי גישה זו עבור יישומים הדורשים ערכה אזורית של ארגון MT. מגבלה קריטית נוספת של מתודולוגיות מסורתית דינמיקת צמיחת MT מדידה כבר ערכות נתונים גדולות מאוד והזמן הדרוש לניתוח נתונים. מגבלה זו נובעת מהצורך למעקב יד של מאה שביטי EB ברזולוציה גבוהה בזמן. יתר על כן, מדידות אלה צריכות להיעשות מספר משמעותי סטטיסטי של תאים וגם בצעו תחת מגוון מלא experimeתנאי פתיחות opening סגירות closures. לאחרונה, האילוצים הללו הוכרעו באמצעות טכניקות ניתוח חישובית מכוונת ספציפית שביטים מעקב EB3 באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות בתאים חיים 35. כאשר נעשה שימוש כראוי, גישה חישובית זה משמש הוא להגביל את הפוטנציאל לטעויות אנושות הקשורים מעקב יד מעבר למתן שיטת תפוקה גבוהה של מדידת פילמור MT. ניתוח חישובית של דינמיקת MT באמצעות חבילת תוכנה מבוססת Matlab, plusTipTracker, מאפשר למדידות של צמיחת MT על ידי מעקב אחר שביטי EB3 שכותרתו fluorescently 5,31,35,38. בנוסף, תוכנת plusTipTracker מאפשרת חישובים של אירועי אסון MT (פירוק aka) מבוסס על העלמות שביטי EB3 בתוך מסלול MT גדל, ומאפשרת משנה הסלולר (aka אזורי) ניתוח של דינמיקת צמיחת MT בתוך אזורים המוגדר על ידי משתמש של עניין . עבור המחקרים שלנו, דינמיקת צמיחת MT הושוותה בתוךאזורים מסועפים לעומת אזורים שאינם קנים, או בתוך מובילים לעומת נגרר קצות תא. פלט נתונים מתוכנת plusTipTracker יכול לשמש גם כדי ליצור שכבות מסלול בצבעים עבור תאים בודדים ואזורי משנה הסלולר. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה ששימשה לחקור את התפקיד של MCAK בויסות הדינמיקה צמיחה MT והתרומה של MT depolymerase זה להסדרת EC הסתעפות מורפולוגיה והגירה כיוונית. הגישה שלנו השתמשה שורת תאים ראשונית אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs), אשר בקלות תרבותית נוחים מאוד, transfection החולף נגרמת electroporation של cDNA פלסמיד. לאחר מכן השתמשו ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של HUVECs טרנספקציה עם סיום MT חלבון מחייב 3 (EB3) ו mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) cDNA -specific בונה כדי לבדוק את ההשפעות על הדינמיקה MT טרנספקציה HUVECs. PlusTipTracker מבוסס ניתוח תמונה חישובית של EB3MT בתוספת הקצוות -labeled היה למדוד מהירויות צמיחת MT ו גלגולי צמיחת MT בתמונות זמן לשגות, למדוד ולהשוות השפעות של מניפולציות ניסיון על דינמיקת צמיחת MT. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקר דינמיקת MT וזיהוי כיצד רגולציה מקומית של דינמיקת MT בתוך אזורי משנה הסלולר תורמת לתהליכי angiogenic של הסתעפות והגירת EC. טכניקות אלו חלות על חקירות של כל MAP כי יכול להיות מתויג fluorescently והביע בתאים חיים.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;mouse IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara cooled charge-coupled device camera</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 goat anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply &amp;amp; Growth Factors (contents shown below)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)&amp;nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Electronic shutter</td><td>Sutter instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contains the electroporation buffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&amp;ndash;pT288&amp;ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&amp;ndash;&amp;alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk&amp;nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells at JoVE.com

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

Video: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioengineering

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Medicine

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video