Name: glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation at JoVE.com

C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

כל הנהלים באמצעות בנושאים בעלי חיים היו בהתאם לסטנדרטים של לשכת טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת מערב מישיגן. 1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חולדות זכרים ונקבה גיל 3 חודשים במחקר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור חיות באור 12 hr / חושך מחזור עם גישה חופשית למזון ומים. </li></ol> 2. הכנת קוקטייל KAX עבור הרדמת בעלי החיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 מ&quot;ג xylazine (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ב 5 מ&quot;ל קטמין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עם 1 מ&quot;ל acepromazine (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו 3 מ&quot;ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר עם מסנן מזרק לאחסן את הפתרון הזה לתוך בקבוק סרום 10 מ&quot;ל. </li></ol> 3. הזרקת KAX <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול בעלי חיים (ז) ולהחזיר לכלוב עד מוכן להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.1 מ&quot;ל KAX / 100 גרם משקל גוף החיה intraperitoneally, באמצעות מזרק אינסולין 1 מ&quot;ל עם מחט 28 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתירעבור החיה איבד את הכרתו. בדוק רפלקסים ידי צובט את הרגליים והזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל החיות בשלום במעבדה למשך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוח, להחליף חיות לתוך הכלובים שלהם ולשמור נוח RT עד התודעה הוא חזר. רק לחזור חיות למתקן חיה כאשר החיות להתעורר ולחדש התנהגות נורמלית. </li></ol> 4. הכנה לכירורגיה ו microneedle אסיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון 2 M NaCl סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חולץ microelectrode (תרשים 1C) כדי למשוך קוטר פנימי אחד 0.86 מ&quot;מ סטנדרטי כבד מלוטשים צינור בורוסיליקט חומה דקה לשתי microneedles זכוכית קוני דק (איור 1D, איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למילוי microneedle אחד מהשלב הקודם עם 2 M מלוחים באמצעות מחט ומילוי מזרק מזרק 1 מ&quot;ל (איור 1B). הקש החוצה בועות אוויר מהקצה של האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק השני 1 מ&quot;ל עם 2 MNaCl. חבר מחט 18 G ולאחר מכן לצרף אורך (כ 10 אינץ &#39;) של (איור 1 א) צינורות פוליאתילן. השתמש בוכנת המזרק כדי למלא את צינורות פוליאתילן עם מי מלח דרך המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הן microneedle הצינורות מלאים מלוח, בזהירות לחבר את השני. הוצא כל אוויר הקשר ביניהם (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דק שפוע קצה microneedle על ידי גירוד זה מאוד קל נגד הזרם של מגבת נייר כמובן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתנגדות של microneedle ידי דחיפת הבוכנה בעדינות על המזרק עד זרם של נוזל בסדר ניתן לראות על מגבת נייר. זרם הנוזל צריך להיות לא יותר מ -0.5 מ&quot;מ. </li></ol> 5. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1 - 2 טיפות הרדמה מקומית כדי קרני (פתרון העיניים Hydrochloride Proparacaine, USP, 0.5%). מתן עד לא רפלקס עינית מתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך שפם עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Saturate מוליך עצת כותנה עם פתרון בבטאדין ואזור ספוגי סביב העין הניסיונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, לצרף hemostat כדי לצבוט את העפעף התחתון לתפוח העין, לחשוף את וריד episcleral ולהגביל תנועת העין. (איור 3, ראש חץ) </li></ol> 6. הזרקת גלאוקומה ותשכנע מלוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הרכבת microneedle והחיה ערוכות, להתחיל זריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החיה אישר שלא להגיב על רגליו / זנב קמצוץ, לנקב את הווריד episcleral בזהירות עם microneedle ידי בא בזווית נמוכה בין 10 ל -20 מעלות אל הווריד (איור 3, חץ לבן). נקב מוצלח לווריד לעין בעת דם נכנס קצה microneedle (איור 3, חץ שחור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט באופן ידני להזריק כ 50 מלוחים μl לווריד. זה אמור לקחת בערך 10 שניות. הוורידים יהיה לבן מחוויר כמו מלח מפיצה throאיכס כלי הדם (איור 4, ראש החץ). אזורים מסוימים עשויים לשמור על חזות אדומה דם (איור 4, חץ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זריקה שנייה לווריד, מול לאתר של הראשון, כדי להבטיח פגיעה ברשתית יסודית כדי שכבת תא גנגליון ברשתית השלמה. הערה: בתוך דקות, אחד צריך לראות עכירות ברורות דרך קשתית העין כמו המלח מפיץ באמצעות מערכת כלי הדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את העין מול מטופל לצורך הקמת בקרה פנימית. </li></ol> 7. שחזור בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את hemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מוליך כותנה ליישם משחה אנטיביוטית משולשת (אבץ Bacitracin, סולפט neomycin, סולפט B polymysin) לאתר הדק ידי hemostat וכדי מוזרקים. נזק לרקמות סביב העין אינה מתרחשת באמצעות hemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &gt; חיות הרדימו מקום בכלובים שלהם על שמיכת מים חמה במחזור כדי קודמותהיפותרמיה אף אוזן גרון. לשמור על חיות תחת השגחה עד תודעת התנהגות נורמלית הם שהעלו. הובלת בעלי חיים ערים בחזרה למושבה החיה. בעלי החיים להישאר במושבה עד הזמן של קרבה. </li></ol> 8. קרבנות והסרה רשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חודש לאחר ההליך לגרום גלאוקומה, בעלי חיים מומתים בחנק CO 2 ו לנקב החזי משנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בחדר ולשים את המכסה על מאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שסתומי CO 2 ו רגולטור גז כדי לאפשר נפח 20% / min CO 2 עקירה של חמצן בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ארבעה עד 5 דקות עבור החיה לפוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את השסתומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיה מהאולם לבצע ניקור בית החזה משני עם אזמל סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המתת חסד, ובעזרת אזמל לחתוך את רקמת החיבור בתוך חלל מסלולית סביב העין, being להיזהר לא לחתוך לתוך גלגל העין עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להשתמש במספרי קצה מעוקלים לחתוך את עצב הראייה וכל רקמה הנותרים כדי לחלץ את גלגל העין השלמה. מניח גלגל עין חילוץ בצלחת פטרי הפנויה 60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ סטרילי המכילה PBS הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עיינית של גלגל העין. לשם כך, לעשות חתך קטן עם האזמל רק אחורי לגבול בין הקשתית בלובן העין. בצע חתך זה סביב ההיקף של העין עם מספריים באביב קטנים להסיר את האונה הקרנית של גלגל העין. ההמיספרה מחובר עצב הראייה נשאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא רשתית ורודה / הבז &#39;דקה מאוד בתוך עיינית מן החיה המורדמת. החזק את שכבת פיגמנט של הרשתית עם מלקחיים קהים לייצב עיינית. השתמש עוד זוג מלקחיים סגורים מאוד להקניט הרשתית השלמה השלמה בעדינות מעל החלק האחורי של העין. הימנע צובט, מושך, או מושך הרשתית ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי מעיין קטנים כדי לחתוך אתהאזור שבו עצב הראייה עדיין מחוברת הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפידו לחתוך משם כל אפיתל הפיגמנט שיורית או רקמות scleral מהרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה, בעדינות מאוד להעביר את הרשתית המבודדת על sylgard נקי מצופה 35 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה PBS הטרי. </li></ol> 9. הכנת רשתית כל ההר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בצלחת sylgard, להשתמש במלקחיים ומחט קקטוס אחד להצמיד את הרשתית במקום. שמור את שכבת התאים הגנגליון ברשתית פונה כלפי מעלה עצב הראייה למטה. צורת חצי כדור של הרשתית בולטת אפילו לאחר קיבוע. העקמומיות של הרשתית תהיה להתכרבל לכיוון התקרה כאשר שכבת תא גנגליון ברשתית היא בכיוון הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים קטנים לחתוך את הרשתית לארבעה רבעים, מה שהופך את הצורה של תלתן בעל ארבעה עלים קורן ראש עצב הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הרביעים של הרשתית עם מחטי קקטוס נוספות כדי להפוך את הרשתית שטוחה ככל האפשר without מתיחה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרשתיות הצמיד בצלחת Sylgard עם 3 מ&quot;ל של 4% paraformaldehyde O / N ב RT. </li></ol> 10. נוגדן מכתים של הרשתית הערה: רשתיות קבועות כתם עם נוגדנים ראשוניים ומשניים לצפייה נוירונים ברשתית (איור 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קבועים, רשתיות שטוחות רכוב שלוש פעמים במשך 2 דקות כל אחד ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize את הרשתיות עם 1% טריטון X-100 עם בסרום שור עוברי 1% ב PBS במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשתיות שלוש פעמים, 2 דקות כל אחד, ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמיים עם 0.1% Triton X-100 ב- PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 1% טריטון X-100 ו בסרום שור עוברי 1% PBS ב RT במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמיים עם 0.1% Triton X-100 ב- PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל רשתית בסרום שור 3 מיליליטר 1% עוברי ב- PBSעם CD90 אנטי עכברוש עכבר מטוהר / העכבר CD90.1 (1: 300 דילול) O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשתיות פעם עם 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעמים עם PBS, 5 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל הרשתית ב 3 מ&quot;ל PBS (לא FBS) עם IgG עז משנית אלקסה פלואוריד 594 אנטי עכבר (1: 300) O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשתיות עם PBS בנדיבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להסיר בזהירות מחטי קקטוס מהרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר רשתיות על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם טפטפת העברה. הקפד לשמור על האוריינטציה עם שכבת תא גנגליון ברשתית מופנה כלפי התקרה. צורת חצי כדור של הרשתית בולטת אפילו לאחר קיבוע. העקמומיות של הרשתית תהיה להתכרבל לכיוון התקרה כאשר שכבת תא גנגליון ברשתית היא בכיוון הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג כל PBS עודף עם KimWipe או חומר סופג כגון אחרים. היזהר שלא לספוג את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 טיפות של ½ גליצרול ½ PBS לפי משקל כמו בבוקרתקשורת ounting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסי רשתית עם coverslip, הימנעות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip מאובטח באמצעות לק ברור, דבק, או דבק אחר. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

פרוטוקול זה מתאר שיטה של גרימת תנאים כמו-גלאוקומה במודל חולדה vivo. הליך זה משתמש זריקה של תמיסת מלח היפרטוני לגרום הצטלקות של meshwork trabecular 29, 32. פיתוח רקמה צלקתית עלולות לחסום את יצוא הומור מימי אשר מגביר את הלחץ בלשכה הקדמית. עם יצוא ולחץ ירד להצטבר, העדשה מושעה על ידי רצועות אלסטי דוחפת חזרה לתוך תא זגוגי. הומור זגוגי אז המפעיל לחץ על הרשתית נזק נוירונים ברשתית שברירי. התוצאות שלנו באמצעות הליך זה להראות כי מספרי תא גנגליון ברשתית מתחילים להתדלדל ב 2 שבועות עם אובדן משמעותי של אובדן תא גנגליון ב-הליך פוסט 1 חודש. פרוטוקול זה הוא רק שיטה אחת של גרימת גלאוקומה במכרסמים. ישנם דגמים ניסיוניים רבים אחרים בהם נזק לתאי הגנגליון ברשתית מושגת באמצעות לעלייה בלחץ התוך עיני או על ידי דה ישירהקוסם אל עצב הראייה 30. לעתים קרובות, שיטות אלו פותחו בבעלי חיים גדולים ו שונה עבור יישום לעכברים וחולדות 33. זריקות תוך-עיניות של רעלים כגון staurosporine 34 ו NMDA, הקבלת גלוטמט הלא hydrolyzable 35 לגרום למות תא גנגליון מהיר רשתית. מחקרים הראו, עם זאת, כי רעלים כגון לעקוב אחרי עקומת מנה-תגובה בעכברים ותאים השפעה מלבד תאי גנגליון היעד 35. בנוסף, הנזק לתאי הגנגליון ברשתית במודל זה הוא הרבה יותר ישיר מאשר התקדמות הדרגתית של גלאוקומה האדם. נזק ישיר אל עצב הראייה יכול להיגרם גם. Axotomy הליזר הוא דרך נפוצה כדי לנתק את האקסונים המרכיבים את עצב הראייה בעכברים 36. עם זאת, שיטה זו מציגה כמה סיבוכים. גודלו הקטן של מסלולים מכרסם מקשה על נזק לעצב הראייה במדויק מבלי להשפיע זרימת הדם דרך העורק המרכזי של הרשתיתו וריד. כדי להתגבר על זה, כמה חוקרים לנצל גישה פולשנית יותר בנוגע להסרה של חלק קטן של המוח על מנת לספק גישה טובה יותר עצב הראייה 37. מודלים למחוץ עצב הראייה לגשת עצב הראייה intraorbitally גם כן. במודל זה, העצב הוא צבט ידי מלקחי סגירה עצמית ואת זרימת דם עיני לא נפגע. הליך זה גורם עלבון מיידי ומוות סינכרוני של תא גנגליון ברשתית. מחקרים שעשו שימוש במודל זה הראה אובדן משמעותי של RGCs 38. עם זאת, יש הטוענים כי היא עלולה לגרום יותר נזק מאשר לנזקים שנגרמו עקב IOP גבוהות לבד 39. בנוסף, גלאוקומה מאופיין איטי, מתמשך, אובדן אסינכרוני של תאי גנגליון ברשתית 33, 39-42 .לכן, במהלך זמן המנגנון הבסיסי של נזקים הנגרמים עם למחוץ עצב הראייה יכול להיות שונה לגמרי מזה המתרחשים גלאוקומה האדם. לעומת זאת, המודל שנדון במאמר זה ימנע את הצורך acce ישירהss בעצב הראייה, מבטל כל דיסקציה של רקמת המוח, ומאפשר ניזק תא גנגליון ברשתית הדרגתי. מודלי חסימת Microbead קלקר גלאוקומת שימוש או חרוזים מגנטיים מוזרקים לתוך התאים הקדמיים של חולדות או עכברים לרומם IOP. רוב העבודה זה כבר נעשה בעכברים והם מראים רק נמוכים עד בינוניים של ניזקי עצב הראייה עם שונות גבוהות של התוצאות ונתונים עקביים 43-50. בעת שימוש חולדות, משך IOP מוגבה היה קצר מכדי לגרום מספיק נזק לתאים 48. אפילו עם שינויים הנוהל, המודל עדיין גרמה לנזק חמור משך קצר המייצג מודל נוירופתי חריפה מאשר מודל גלאוקומה כרונית 51. Smedowski ואח 43 לאחרונה פיתחנו תהליך microbead שופר עוד יותר באמצעות &#39;פגיעה בלחץ גבוה &quot;הראשונית נוסף כדי להשיג יותר מתמיד העלאת IOP עם נזק כרוני כי איילהמופע הבטחה. מחקרים נוספים באמצעות טכניקה זו נחוצים נוסף כדי לאמת את המודל הזה. מודלים של יתר לחץ דם עיניים כרוני שואפים להכשיל יצוא הומור מימי. Photocoagulation לייזר של episcleral וורידים לימבלית 52 ו חסימה בווריד episcleral 53 שתי שיטות כאלה. עם זאת, זה גם הוכח כי טכניקות אבלציה לייזר לייצר העלאת IOP חולף בלבד בעוצמה בינונית של אובדן התא בפועל 36, 54-55. גלאוקומה היא מחלה כרונית כתוצאה מנזקים ואובדן תאי הגנגליון ברשתית אשר אקסונים שמרכיבים את עצב הראייה. המנגנון של הפסד זה אינו ידוע. בעוד לעלייה בלחץ התוך עיני הוא סימן ההיכר גורם הסיכון, טענו חלק מעורבותם של גורמים אחרים. גורמים אלה כוללים תהליכים דלקתיים, סטרס חמצוני, אי סדירות מטבולית, או הפרעות בזרימת הדם 56-58. על מנת לחשוף את המנגנון המדויק של cell מוות במחלה זו, חוקרים צריכים דרכים פשוטות, דיר, ופונקציונליות לתנאים לחקות במדויק המופיעים גלאוקומת אדם. רק אז יוכלו חוקרים למצוא דרך כדי להגן על תאים הגנגליון ברשתית מהמוות. ההליך המתואר במאמר זה משתמש העלאה שנגרמה באופן מלאכותי של IOP לייצר אובדן הדרגתי, בלתי הפיך של תאי גנגליון רשתית דומים לזו שנצפתה בקרב חולים בגלאוקומה 31. הנוהל הוא פולשנית. פסד תא גנגליון ברשתית משמעותי נמדד תוך חודש מיום הניתוח. שיטה זו היא כלי משמעותי אחד לחקר הגלאוקומה. מגבלה פוטנציאל של שיטה זו היא ההזרקה הידנית של מלוחים היפרטוני. בגלל שיטה ידנית זה, אפשר לצפות שונה גדול בתוצאות. עם זאת, זיהינו את האפקט הלבן בווריד להיות צעד קריטי. אם הלבנה מתרחשת, אובדן תא גנגליון ברשתית היא תמיד בין 18 ו -29%. כדי לתמוך בכך, כל המחקרים בעתיד יכולים מודיםפ.י. ההליך לכלול מדידות לחץ תוך עיני שגרתית על מנת להבטיח כי זריקות אלו להביא לעלייה למדידה בלחץ תוך עיני. 29,31. אולי המודל הזה של המוות RGC יוביל לפיתוח טיפול נוירו שלם יותר כי להילחם בתופעת אובדן ראייה הרסנית להשפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם.

גלאוקומה היא קבוצה של מחלות עיניים המשפיעות נוירונים ברשתית, במיוחד, התאים הגנגליון ברשתית 1-2. אקסונים של תאים אלה להתכנס על מנת להפוך את עצב הראייה נושא מידע חזותי אל המוח, שם לחזון נתפס. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם ולכן גורם פגמים חזותיים. מאפייניו העיקריים הקשורים להפרעות גלאוקומה הם RGC ניוון ומוות, לחץ תוך עיני מוגבר (IOP), וכוסות רוח דיסק אופטי וניוון. תכונות אלה להוביל לאובדן שדה ראייה או מלא, לעיוורון בלתי הפיך. נכון לעכשיו, גלאוקומה גרמה עיוורון ב -70 מיליון אנשים ברחבי העולם 3. ככזה, הוא הוא הגורם השלישי בגודלה בעולם של עיוורון 4. המנגנון המדויק של מות RGC בגלאוקומה נותר עלום. מחקר רב נעשה כדי לפתוח את התעלומה. זה ידוע, עם זאת, כי גורם הסיכון העיקרי של גלאוקומה היא תגדילn לחץ תוך עיני עקב זרימה סדירה הומור מימי (AH) בחדר הקדמי של העין. AH פועל כתחליף שקוף וחסר צבע לדם בתא avascular הקדמי של העין. היא מזינה את התאים הסובבים אותו, מסיר פסולת המופרשים תהליכים מטבוליים, משלוחים נוירוטרנסמיטורים, ומתירה את זרימת סמי תאים דלקתיים בתוך העין במהלך מצבי פתולוגיים 1. התחזוקה של זרימת הומור מימית כרוכה הגוף ריסי ואת meshwork trabecular. הומור מימי מיוצר על ידי הגוף ריסי. לאחר מכן הוא זורם לתוך החדר הקדמי כדי לשמור על הבריאות הכללית של רקמות העין. 75 - 80% יצוא הומור מימי מופרשים באופן פעיל באמצעות אפיתל ריסי הלא פיגמנט כאשר הנוזל מסונן דרך שלוש שכבות של מרקם ספוגי בשריר הריסים. יציאות הנוזל דרך meshwork trabecular ודרך התעלה של Schlemm אשר ולרומםies לתוך מערכת הדם 5 .the הנותרים 20 - 25% של יצוא עוקף את meshwork trabecular ומופרש באופן פסיבי על ידי אולטרה סינון ודיפוזיה דרך מסלול uveo-scleral. מסלול זה מופיע להיות עצמאי יחסי של לחץ תוך עיני 1. כאשר ייצור הומור מימי ו יצוא נמצא מחוץ איזון, לחץ בונה בתוך העין. כאמור, זו עלייה בלחץ התוך עיני הוא גורם הסיכון העיקרי להתפתחות גלאוקומה. לחץ כזו גורמת נזק שכבות סבוכה של נוירונים ברשתית בחלק האחורי של העין. פגיעת אקסונים תא גנגליון ברשתית של עצב הראייה גורמת למוח כבר לא מקבל מידע חזותי מדויק. כתוצאה מכך, תפיסת החזון אבדה עיוורון מוחלט יכול להתרחש. נכון להיום, אין תרופה לגלאוקומה. שיטות טיפול שונות קיימות בעיקר שמטרתם להפחית לחץ תוך עיניים. אלה כוללים אקטואלייםכיתות תרופות כגון חוסמי הקולטן-אדרנרגיים beta1, או אנלוגים פרוסטגלנדין אקטואליים. חוסמי ביתא להפחית את הלחץ התוך עיני על ידי הפחתת הייצור של הומור מימית 7. פרוסטגלנדינים לתפקד להפחית IOP ידי הגדלת היצוא של הומור מימי 8-14. אגוניסטים אלפא אדרנרגיים ומעכבי anhydrase פחמתית משמשים גם כאמצעי משני של הטיפול. אגוניסטים אדרנרגיים אלפא להגדיל יצוא דרך מסלול uveoscleral 15-17. מעכבי anhydrase פחמן להפחית את ייצור AH ידי עיכוב אנזימטי 18. הרבה יותר פרוצדורות פולשניות גם נמצאות בשימוש לטיפול בגלאוקומה. Trabeculoplasty לייזר משמש כדי להגדיל את תזרים הומור מימית 19. עוד טיפול כירורגים, שנקרא trabeculectomy, יוצר אתר ניקוז אלטרנטיבה לסנן AH כאשר מסלול trabecular המסורתי חסום 20-21. אפשרויות טיפול אלה היו ידועים EFFectively להפחית IOP. עם זאת, עד 40% של מחלת גלאוקומה להראות לרמות נורמליות IOP מה שמעידים על צורך בשיטות טיפוליות שלמות יותר. 22,23 בנוסף, מוות של תאי הגנגליון ברשתית לראות גלאוקומה הוא בלתי הפיך פעם זה מתחיל וטיפולים נוכחיים לא לעצור את התקדמות המחלה 24-28. זה הדגיש את הצורך טיפולים נוירו יעילים הממקדים ההישרדות של הנוירונים עצמם. פיתוח דגמי גלאוקומה הוא קריטי להתפתחות זו. במחקר זה אנחנו מפגינים שיטה של גרימת תופעות כמו-גלאוקומת חולדות מבוגרות לונג אוונס באמצעות הליך שונה המפורטים במקור על ידי מוריסון 29. בהליך זה, זריקות של 2 M מלוחים היפרטוני לתוך מקלעת ורידית episcleral גורם תנאים כמו-גלאוקומה על ידי הצטלקות רקמת להפחית יצוא הומור מימית של meshwork trabecular מה שמוביל לעלייה בלחץ התוך עיני ואת אובדן משמעותי של RGCs within חודש של ההליך 30-31. גלאוקומה וישכנע נהלים, כגון זה המתואר כאן, עשויים להיות המפתח לפיצוח פיתוחים חדשים טיפולי גלאוקומה.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

גלאוקומה היא מחלה של מערכת העצבים המרכזית הפוגעת בתאי הגנגליון ברשתית (RGCs). אקסונים RGC המרכיבים את עצב הראייה לשאת קלט חזותי למוח עבור תפיסה חזותית. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם מובילה לאובדן ראייה ו / או עיוורון. למרות הגורם הספציפי של גלאוקומה אינו ידוע, גורם הסיכון העיקרי למחלה הוא לחץ תוך עיני מוגבר. גלאוקומה וישכנע נהלים במודלים של בעלי חיים הם כלים רבי ערך לחוקרים לחקור את מנגנון מות RGC. מידע כזה יכול להוביל לפיתוח טיפולים נוירו יעילים שיכולים לסייע במניעת אובדן ראייה. פרוטוקול במאמר זה מתאר שיטה של גרימת גלאוקומה - כמו תנאים במודל חולדה vivo ב שם 50 μl של 2 מלוחים היפרטוני M מוזרק לתוך מקלעת ורידית episcleral. לבנה של הכלי מציינת זריקה מוצלחת. הליך זה גורם לאובדן של RGCs לדמות גלאוקומה. החודש הבאזריקה, חיות מוקרבות ועיניים יוסרו. לאחר מכן, הקרנית, העדשה, זגוגי מוסרים לעשות עיינית. הרשתית היא מקולפת ואז מהחלק האחורי של העין והצמידה על מנות Sylgard באמצעות מחטי קקטוס. בשלב זה, נוירונים ברשתית יכול להיות מוכתם לניתוח. תוצאות מהמעבדה זה מראים כי כ -25% RGCs הולכים לאיבוד בתוך חודש אחד של ההליך כאשר בהשוואה לקבוצת הביקורת הפנימית. הליך זה מאפשר ניתוח כמותי של מוות תאי הגנגליון ברשתית במודל גלאוקומה עכברוש in vivo.

סעיף זה ממחיש את מרכיבי מנגנון הליך המשמשים כדי לעודד תנאים דמויי גלאוקומה במודל גלאוקומה in vivo חולדה. אנחנו מראים את הכלים הפרט וציוד המשמשים לבצע הזרקת סליין היפרטוני הגורמת לעלייה בלחץ התוך עיני. אנו מציגים את ההזרקה לתוך המקלעת ורידית episcleral עם האפקט הלבן המאפיין שלה ואת העכירות של הלשכה הקדמית שנוצרו כתוצאה מכך. כמו כן, אנו מתארים את התהליך של הסרת רשתית שטוחת הרכבת ניתוח הרכב אבד RGCs. לבסוף, אנו מראים את ההשפעות של ההזרקה על הישרדות תא גנגליון ברשתית. כמו חלוקת RGCs אינה אחידה באזורים שונים של רשתית העכברוש, תמונות מתקבלות ארבעה 200 מיקרומטר 2 אזורים בכל רשתית, 4 מ&quot;מ מהמרכז של ראש עצב הראייה. המספר הכולל של RGCs שכותרתו 1.1 Thy בכל סעיף נספר, בממוצע ולעומת ב ניסיוני contr<html> ol רשתיות 31. באמצעות שיטה זו, ספירות RGC השתנו מממוצע של 225 בתמונת תנאי קבוצת ביקורת של 168 חודש לאחר ההליך כדי לגרום תנאי גלאוקומה דמוית (N = 30). יחדיו, את ההנחיות המתוארות כאן ניתן בעקבות צעד אחר צעד כדי לנתח את מותו של גופים אקסונים תא גנגליון ברשתית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig1.jpg" /> איור 1. רכיבי microneedle. (א) מזרק עם צינורות פוליאתילן המשמשים להזרקה מלוחה. (ב) מזרק מילוי חוזר בשימוש לבצע מילוי חוזר של microneedle בורוסיליקט. (C) Narishige אלקטרודה חולץ המשמש לייצור microneedles בורוסיליקט. (ד) אלקטרודות זכוכית בורוסיליקט לפני ואחרי שנגרר ב האלקטרודה חולץ. (E) יתגדל לאור קצה מחט microelectrode לאחר שנגרר.&quot;Target =&quot; ftp_upload / 53,831 / 53831fig1large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig2.jpg" /> איור 2. שלם microneedle עצרת. Microneedle מצורפת צינורות פוליאתילן מצורפים מזרק עם מי מלח היפרטוני. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53831/53831fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig3.jpg" /> איור 3. גלאוקומה ותשכנע הזרקת תמיסת מלח לתוך Episcleral ורידי מקלעת. תמונה של הזרקה מלוחה לוריד episcleral של חיה, מורדמת לונג אוונס חולדה. ראש החץ מצביע על מיקומו של hemostat בשימוש לתפוח העין ולמנוע את תנועתה. החץ הלבן מצביע על<html> מיקומו של הווריד המוזרק. החץ השחור תערוכות בחזרה דם זורם לתוך קצה microneedle המציין לנקב וריד מוצלח. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53831/53831fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig4.jpg" /> איור 4. לבנת שפעת היפרטוני מלוחה הזרקה. תמונה של עין עכברוש שהוזרק לו מלוחים היפרטוני. ראש החץ מראה את ההשפעה הלבנה אופייני מלוחים מקלעת ורידית episcleral. החץ מצביע על החלק של מקלעת ורידית episcleral שלא החוויר עדיין. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53831/53831fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 31 / 53831fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. שטוח הר חולדת הרשתית. תמונה של רשתית הר שלמה הוסרה מן עין העכברוש וצמיד שטוח בצלחת Sylgard באמצעות מחטי קקטוס. החץ השחור מציין את ראש עצב הראייה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53831/53831fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53831/53831fig6.jpg" /> נזק איור 6. לתאי גנגליון רשתית לאחר ניתוח וישכנע גלאוקומה. השוואה בין עין קבוצת הביקורת (א) בעין ניסיוני (B) חודש לאחר קבלת גלאוקומה התרמה הזרקת מי מלח. הרשתיות תויגו עם נוגדן כנגד סמן RGC, Thy 1.1 (CD90). חיצי Thin מצביעים RGCs הפרט הוא מלא תנאי ניסוי. ההליך מוביל לירידה במספר RGCs, דהfasciculation של אקסונים את חבילות האקסון הראשי, ועיוות את המעגליות של RGCs הנותרים. החיצים החלולים לציין את האקסונים מאפיין defasciculating הנובעים הזרקת מי מלח. ראש החץ מצביע על כלי דם בתוך הרשתית. חבילות האקסון תווית חיצי פעמים הסתיימו. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53831/53831fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation at JoVE.com

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K Views.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Video: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Neuroscience

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Bioengineering

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

לחסימה Microbead מגנטי דגם כדי לגרום Ocular Hypertension-Dependent גלאוקומה עכברים

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

המודל המכרסם של Nonarteritic Anterior Ischemic Optic נוירופתיה (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

דגם של גלאוקומה המושרה על ידי תפרים Circumlimbal אצל חולדות ועכברים

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Biology

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. Accessing the rat optic nerve for experimental manipulations and injections is challenging due to the small size of the orbit and the vascularity of the surrounding orbital tissues. Previous techniques have involved a cutaneous incision, which carries a higher risk of infection and requires wound closure. This study aims to describe a unique, less invasive, and potentially more efficient approach to accessing the rat optic nerve. A transconjunctival incision, along with a rat spinal cord hook, is used to isolate the optic nerve for experimental injections. In these experiments, an adenoviral vector is injected into the optic nerve with the goal of using this technique for direct gene therapy delivery in the future. This technique can also be applied by investigators requiring access to the rat optic nerve for other experimental studies, including drug delivery and optic nerve injury research.

This protocol describes a unique technique using a transconjunctival approach to access the rat optic nerve for injections.

גישה טרנס-לחמית להזרקה לעצב הראייה של החולדה

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

טכניקת הזרקת מי מלח היפרטוניים לגרימת גלאוקומה בחולדות

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video