Name: an endothelial planar cell model for imaging immunological synapse dynamics
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics at JoVE.com

We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).

<ol>
	<li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin.">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+receptors+of+the+immune+system.">Adhesion receptors of the immune system.</a> Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).</li><li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance:+a+topological+view+of+T+cell+activation.">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li><li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue.">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li><li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse.">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+context+of+T+cell+signaling.">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li><li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+complexes+and+clusters:+functional+advantages+and+methodological+hurdles.">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li><li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers.">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies.">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters.">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies.">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li><li>Martinelli, R., Carman, C. V., Bradshaw, R. A., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+Endothelilal+Interactions.">Lymphocyte Endothelilal Interactions.</a> Encyclopedia of Cell Biology. , (2015).</li><li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions.">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+by+the+endothelium:+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking?.">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li><li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory/effector+T+cells.">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+.">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li><li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells.">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li><li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by,+but+not+differentiation+of,+naive+CD4++T+cells.">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li><li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+antigen+presentation:+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells.">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li><li>Epperson, D. E., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+function+of+human+endothelial+cells.+Direct+activation+of+resting+CD8+T+cells.">Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells.</a> J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).</li><li>Shiao, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+effector+memory+CD4++T+cells+directly+recognize+allogeneic+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-signal+model+for+T+cell+trafficking.">A two-signal model for T cell trafficking.</a> Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).</li><li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+diapedesis+is+initiated+by+invasive+podosomes.">Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes.</a> Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).</li><li>Carman, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+transcellular+diapedesis:+probing+and+pathfinding+by+'invadosome-like+protrusions'.">Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'.</a> J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).</li><li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses.">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li><li>Saito, T., Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+synapse+and+microclusters:+the+site+for+recognition+and+activation+of+T+cells.">Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells.</a> Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).</li><li>Gomez, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HS1+functions+as+an+essential+actin-regulatory+adaptor+protein+at+the+immune+synapse.">HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse.</a> Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).</li><li>Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+signaling+to+integrins.">T-cell receptor signaling to integrins.</a> Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).</li><li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses.">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li><li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering.">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li><li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity.">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).</li><li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes.">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif.">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי האנדותל כט) נגמ&quot;שים פיסיולוגיים understudied וii) כסוג חדש של &#39;מודל APC הסלולרי מישוריים&#39;. עם כל כבוד ללשעבר, זה הפך להיות יותר ויותר מוערך שנגמ&quot;שים שאינם hematopoietic ההיקפי (או &#39;סטרומה&#39;) ממלאים תפקידים קריטיים, שאינם מיותרים (כלומר, בהשוואה לנגמ&quot;שים hematopoietic) בעיצוב תגובות חיסוניים אדפטיבית 16-18. בין ההערכה הטובה ביותר 16-18 בין כגון נגמ&quot;שים &quot;חצי מקצועיים&quot;, כלי דם ותאי הלימפה האנדותל (שהמספר בהרבה נגמ&quot;שים מקצועיים) הם. עם זאת, את הפרטים של אירועי אזעקה וסינפסות החיסונית בשילובם להישאר במידה רבה שלא נחקרו. השיטות שתוארו במסמך זה מספקים בסיס לקידום הבנה בתחום זה מתפתח. לדוגמא, יישום גישות אלה לחקר ISS נוצר על האנדותל מרקמות שונות שידועות כי הם מפגינים adaptiv מובחןדואר פונקציה חיסונית (לדוגמא, בכבד ובendothelia הלימפה) יכול להיות במיוחד מאלף. באופן משמעותי, בשיטה זו מסייעת לגשר על הפער בין נגמ&quot;שים מקצועיים ודגמי מצע APC מלאכותיים כדי לשפר את היכולת לחקור את המנגנונים בסיסיים של תגובות חיסוניים אדפטיבית. בעוד מצעים מישוריים APC (כלומר, bilayers שומנים, זכוכית מצופה נוגדנים) מספק הדמיה אופטימלית (שיוביל לתובנות רבות קריטיות 7,11-14), מודלים כאלה הם מטבעו מוגבלים. לחלופין, פרטים של דינמיקת סריקת תאי תאים פיזיולוגית עד כה טושטשו עמוקות נושאים הקשורים להדמיה אורינטציה 8-10. יכולות ההדמיה מסופקות בגישה הנוכחית להתגבר על מכשול זה לחשוף ארכיטקטורה אחרת לגילוי תלת ממדי subcellular ושיפוץ מהיר של ממשק תא APC-T פיסיולוגי ייחודי. הצעה פוטנציאלית אלה להבנה חדשה של סיגנליזטורי אנטיגניז. לדוגמא, ההערכה שתאי T יוצרים ILPs מועשר בTCR, אקטין ומולקולות איתות (למשל, איור 2 ד, איור 3), מצביעה על כך שהללו עשויים לייצג פיסיולוגיים נגד החלקים 3 ממדים לTCR מישוריים איתות מיקרו-אשכולות שנצפו ב APC המלאכותי מצעי 6,7,12-14,29-31. משמעות הדבר הוא כי תחת הגדרות פיזיולוגיות, לימפוציטים יכולים להעסיק ILPs כ&#39;כרכי 3D-תגובה &#39;בדידים subcellular עם מאפיינים&#39; כמו signalosome&#39;-שלהגביר ולקיים איתות על ידי ריכוז מולקולות / פעילויות חשובות 32,33. בנוסף, הנוכחות של תשומות משמעותיות ביו-מכאניות (כלומר, יישום כוח תא-תא) במראות אם בליטת ILP נגד APC ניתן להסיק מההדמיה. זה טריוויאלי כמו כוחות מכאניים נתפסים יותר ויותר כמנחים קריטיים של איתות אנטיגני, בעוד בדיוק איך כגון כוחות הםבאנו לידי הביטוי לא ברור 14,34-37. רלוונטי הכוללת של מודל זה כתחליף סביר לנגמ&quot;שים מקצועיים נתמכת על ידי ההפגנה הישירה שלנו שמערכים ILP דומים ניתן היו לראות בסינפסות נוצרה על ECS ו DCS (ומידה פחותה יותר תאי B) כאשר גישות הדמיה מקבילות הועסקו (למשל , שימוש באותו מקבלי הקרינה והשליטה במטוס הנטייה המטוס הוא 19). עם זאת, הוא צריך לקחת בחשבון שהתכונות ביו-המכאניות היחסית של EC לעומת משטחי קרום APC מקצועיים אינן ידועות וכי הבדלים בפרמטר זה יכול להשפיע על פרטים של הטופולוגיה ותגובות אנטיגני. המפתח לגישה המתוארת במסמך זה מאוד קשור ליתרונות הרזולוציה שלה. זה, בתורו הוא קשור מאוד לעוצמת אות הקרינה. לפיכך, חשוב להקדיש תשומת לב מיוחדת באופטימיזציה transfection וצביעת fluoresכתבי אחוזים ופרמטרי הדמיה / טכניקה (למשל, זמן חשיפה, פוקוס, וכו &#39;...). עם כל כבוד ללשעבר, הפרוטוקול ללימודים לחיות תאים שתוארו כאן הם מוגבל לtransfection של קרום גנריות וסמני cytoplasmic שלדווח על שינויי טופולוגי בממשק T התא-APC בזמן אמת (למשל, איור 2, 1 סרטים, 2). בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות שונה בקלות לניתוח מתוחכם יותר על ידי / כתבים נוספים במקביל הדמיה מציגים בהאנדותל (למשל, ניאון MHCI / השני והדבקה, מולקולות מעכבות שיתוף שיתוף גירוי וחיישנים עבור אזעקה וביו-מכאני-מתויג חלבון דִינָמִיקָה). למרבה הצער, עם זאת, הגבלה כללית היא שימפוציטים הם ידועים לשמצה קשה transfect. זה מונע את השימוש נוח של חלבוני ניאון (למשל, מתויג לTCR, PKC-Q, וכו &#39;) בתאי T עבור הדמיה תא חי. בזמןהפרוטוקול הנוכחי כרוך הפעלה של לימפוציטים מסוג מפעיל / זיכרון אנושי מסוג CD4 + Th1 דרך SAG (מודל נפוץ), אפשרויות רחבות הרבה יותר קיימות. כפי שהודגם בעבר 19,20 גישה זו היא בקלות להתאמה למגוון רחב של הגדרות אחרות כגון תגובות של תת אחרות מסוג CD4 + והפעלה של תגובות הרג הלימפוציטים CD8 +. באמצעות בידוד של לימפוציטים ותאי האנדותל מזני TCR-מהונדס קיימים בשיטה זו היא גם להתאמה בקלות ללמוד תגובות לאנטיגנים ספציפיים פפטיד 19,20. לבסוף, הגישה הנוכחית מוגבלת לבדיקה של תאי T מפעיל / זיכרון. עם זאת, transfection של תאי האנדותל עם מולקולות שיתוף גירוי החיוניות (CD80 / 86, בדרך כלל לא באו לידי ביטוי בהאנדותל) עשוי לאפשר ללימוד דינמיקה תחול תא נאיבי במודל זה.

לימפוציטים מסוג T הוא סניף של המערכת החיסונית אדפטיבית המאופיינת ביכולת לזהות ביעילות אנטיגן פפטיד (Ag) חייבת מורכב histocompatibility גדול (MHC) מולקולות באמצעות קולטנים של תאי T (TCRs) 1. לימפוציטים נאיביים constitutively להעביר ולסרוק תאים מקצועיים Ag הצגה &#39;(נגמ&quot;שים; למשל, תאים דנדריטים) בתוך בלוטות הלימפה, בעוד תאי הזיכרון / T מפעיל צריכים לסקור מגוון רחב מאוד של נגמ&quot;שים ותאי יעד פוטנציאליים בתוך רקמות היקפי ביעילות. בדקות הבאות הכרה ראשונית של Ag מקור על APC, ימפוציטים לעצור הגירתם ומתחיל להיווצר ממשק תאי תאים אינטימי מיוחד &quot;סינפסה החיסונית &#39;כינתה (IS). ספג (כלומר, 30-60 דקות) היא קשר נדרש להגביר ולקיים איתות 2-7. מחקרים המתעוררים לזהות שבתוך הוא, זה הוא ההיווצרות רציפה ומהיר remodeling של מיקרו-אשכולות בדידים איתות תת-תאי (כלומר, מכילים MHC / Ag-TCR, F- אקטין, הדבקה ומולקולות איתות) הקובעים את החוזק והאיכות של תגובות חיסוני וכתוצאה מכך 2-7. עם זאת, פרטים דינמיים ומנגנון רגולציה של תהליך זה באופן חלקי הבינו 8,9. זה נובע במידה רבה מאתגרים טכניים הקשורים בטופולוגיות סדירות של משטחי APC ונטייה גרועים מבוקרת של מטוסי האינטראקציה תאי תאים, נושאים שעמוקים להגביל את ההדמיה spatiotemporal הנדרשת גישות 8-10 (Figure1A). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> איור 1. דגם APC התא פיסיולוגי מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics. סכמטי ממחיש הדמיה מסורתית של סינפסה החיסונית בין תאי T וprofessio<html> תא סופי APC () ו- T ומודל מסורתי שומנים מישוריים APC bilayer (ב &#39;) בהשוואה למודל זה רומן אנדותל APC מישוריים (C). נגמ&quot;שים מקצועיים לספק סינפסות החיסונית פיזיולוגית אבל מציעים ממשק מונחה גרוע תא-תא (כלומר, ביחס למישור ההדמיה XY האופטימלי; רזולוציה ~ 0.2 מיקרומטר), אשר באופן דרמטי פוגע מרחבית (רזולוציה ~ מיקרומטר מטוס ההדמיה z 1) ובזמן (כלומר, בשל הצורך לסרוק שוב ושוב בכל מטוסי ההדמיה z) רזולוציה של הדמיה. יש דגמי bilayer טופולוגיה מישוריים המספקת רזולוציה ההדמיה spatiotemporal אופטימלית, אבל גם פשוטים ביותר, שאינם פיסיולוגי ונוקשה. מודל תא האנדותל זה משלב את הטופולוגיה מישוריים של bilayers שומנים עם המצע הפיזיולוגי של APC קלאסי כדי לספק רזולוציה הדמיה מרחב ובזמן אופטימלית בסביבה פיזיולוגית.מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 53,288 53288fig1large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. העבודה קודמת עקפה באופן חלקי על המכשולים הללו על ידי פיתוח מודלים מצע מישוריים (כלומר, bilayers שומנים ומשטחים מצופים נוגדנים) המספקים רזולוציה spatiotemporal אופטימלית (כלומר, באמצעות תיקון משטח הפעלת תא T לתכנית אחת שמקבילה להדמית XY האופטימלית מטוס) 11-15 (1B איור). מודלים אלה הקלו תובנות חשובות דינמיקת subcellular / מולקולרית השולטות איתות אנטיגני בתאי T, כוללים גילוי אקטין דינמי / TCR מיקרו-אשכולות איתות 7,11-14. עם זאת, מודלים כאלה מטבעם פשטניים, כמו גם נוקשה (מניעת הפיתוח / המחקר של תכונות טופולוגי 3 ממדים) (איור 1). לכן, זה עדיין לא ברור איך להתייחס כגון ממצאים לPHYתאי תאים siologic מעקב חיסוני. למרות שעדיין understudied, כלי דם ותאי האנדותל הלימפה הם מתעוררים כגדולים (כלומר, גדולים יותר במספרים מכל נגמ&quot;שים המקצועיים, על ידי ~ 1000-פי) תא היקפי של נגמ&quot;שים &quot;חצי מקצועי&quot; 16-18. תאים אלה מבטאים MHC-אני-, MHC-II- ושפע של מולקולות שיתוף ממריץ (למשל, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, אבל לא CD80 וCD86) ואסטרטגיים ממוקם בממשק שבין דם לרקמה שבו הם משרתים פונקציות זקיף מיוחדות 16-18. מחקרים קודמים הראו שתאי האנדותל יכולים למעשה מחדש לעורר מפעיל / זיכרון, אבל לא נאיבי, תאי T 19-25. כך, תאי האנדותל עשויים לשחק תפקידי APC ייחודיים בשלב מפעיל של תגובות חיסוניים אדפטיבית בתוך הרקמות ההיקפית, כגון השפעה מקומית על הפעלת תא T, בידול, זיכרון וסובלנות 16,17,26. CRItically, כאשר גדלו במבחנה, תאי האנדותל יוצרים משטחי תא כמעט מישורי והם בקלות transfectable (למשל, עם כתבי חלבון פלואורסצנטי). תכונות אלה הן אידיאליים עבור הדמיה גבוהה spatiotemporal רזולוציה של דינמיקה טופולוגית במהלך אינטראקציות תא-תא 19,27. כך תאי האנדותל עשויים לשמש כמודל &#39;מישוריים סלולארי APC&#39; פיסיולוגי מובהק מתאים ללימוד מנגנוני שיפוץ subcellular / מולקולריים המניעה את הכרת אנטיגן ולווסת תגובות (איור 1 ג) 19,20. בעבר הוקם טכניקות הדמיה משלימות (כולל transfection של תאי endothelia עם מקבלי חלבון פלואורסצנטי של קרום הפלזמה וcytosol) ללומד את הפרטים של אינטראקציה ליקוציט-האנדותל בהידבקות וההגירה Transendothelial 27, הראה כי לויקוציטים באופן פעיל לחקור את פני השטח של האנדותל ידי דינמי הכנסהההכחשה ד של תת-מיקרון בקנה מידה, בליטות גליליות אקטין עשיר (~ 200-1,000 ננומטר בקוטר ועומק) כינו בליטות כמו invadosome (כלומר, &#39;ILPs&#39;) 27,28. הדמיה גישות אלה הורחבו עוד יותר יחד עם יצירת הפרוטוקולים לנצל פונקצית APC אנדותל לפתח השיטות הראשונות להדמיה גבוהה spatiotemporal רזולוציה של סינפסה החיסונית תא אנדותל T כ19,20 דיווח ועוד לתאר זאת. ממצא מרכזי הנגזר ממודל APC סלולארי זה מישוריים רומן הוא שILPs תא T לתפקד גם בקידום זיהוי Ag ראשוני ובשמירת איתות שלאחר מכן. ואכן, מערכים של ILPs מרובה (שהתייצבו ונצבר בתגובה הראשונית שטף סידן) להעשרת תכנית בTCR ומולקולות רמיזות של PKC-Q איתות פעילה כגון, ZAP-70, phosphotyrosine וHS1. לכן, ILPs נראה לייצג מקביל פיסיולוגי תלת-ממדית למייקרו-TCR האיתותאשכולות ראו בדגמי bilayer מישוריים. גישה זו, ובכך, ברגישות מגלה / דינמיקה מולקולרית ואדריכלית (ומשתמע ביו-מכאנית) דיווחים לא אחרת לזיהוי. השיטה המתוארת במסמך זה צריכה להיות שימושי לגישור על הפער בין APC המקצועי ודגמי מצע APC מלאכותיים כדי לשפר את היכולת שלנו לחקור את המנגנונים בסיסיים של תגובות חיסוניים אדפטיבית. ואילו כאן הדגש הוא על ההפעלה של מפעיל CD4 + סוג Th1 / תא זיכרון, גישה בסיסית זו ניתן לשנות בקלות ללמוד מגוון רחב של סוגי תאי T וAGS, כמפורט להלן.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer stretch latex free tourniquet</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD alcohol swabs</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Bring to RT before use</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>staphylococcal enterotoxin B</td><td>Toxin Technology</td><td>BT202RED</td><td>Stock solution 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>toxic shock syndrome toxin 1</td><td>Toxin Technology</td><td>TT606RED</td><td>Stock solution 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>human IL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Stock solution 50ug/ml in PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Stock solution 10x, dilute in PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Required Kit for step 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>phenol Red-free HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Stock solution 1M in H20</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Stock solution 1M in H20</td></tr><tr><td>Human Serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Stock solution 1mM in DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Toxic, use fumehood</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Corning Cell Culture Treated T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&amp;nbsp;</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Falcon Tissue Culture Plates 24-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Delta-T plates</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Disposable Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;ICAM1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&amp;reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Class II antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Talin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKC theta antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>phosphotyrosine (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Required electroporator for step 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Forma STRCYCLE 37 &amp;deg;C, 5% CO2 Cell culture Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr><tr><td>Isotemp Waterbath model 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

an endothelial planar cell model for imaging immunological synapse dynamics

חסינות מסתגלת מוסדרת על ידי אינטראקציות דינמיות בין תאי T ותאי הצגת אנטיגן (&#39;נגמ&quot;שים&#39;) המכונה &quot;סינפסות החיסונית&quot;. בתוך ממשקי תאי תאים האינטימיים אלה אשכולות בדידים משנה הסלולר של MHC / Ag-TCR, F- אקטין, הדבקה ויוצרים מולקולות איתות ולשפץ במהירות. דינמיקה אלה נחשבות לגורמים קריטיים של שתי היעילות והאיכות של התגובות חיסוני המתפתחות ולכן של מגן לעומת חסינות פתולוגיים. הבנה נוכחית של סינפסות החיסונית עם נגמ&quot;שים פיסיולוגיים היא מוגבלת על ידי חוסר ההתאמה של הרזולוציה ההדמיה השגה. למרות שמודלים מלאכותיים מצע (למשל, bilayers שומנים מישוריים) מציעים רזולוציה מעולה והיו כלים יקרים מאוד, הם מטבעם אינו פיסיולוגיים ופשטניים. תאי האנדותל של כלי דם והלימפה צמחו כתא רקמה היקפית חשובה (או סטרומה) ​​של &#39;חצי מקצועאל נגמ&quot;שים &quot;. נגמ&quot;שים אלה (המבטאים ביותר של המכונות מולקולריות של נגמ&quot;שים מקצועיים) יש התכונה הייחודית של יצירת תא שטח כמעט מישורי והם בקלות transfectable (למשל, עם כתבי חלבון פלואורסצנטי). במסמך גישה בסיסית ליישום תאי האנדותל כרומן ו&#39;מודל APC הסלולרי מישוריים &#39;פיסיולוגי להדמיה וחקירה של תהליכי איתות אנטיגני הבסיסיים משופרות תתואר.

גישת הדמיה רומן באמצעות תאי האנדותל ושילוב יתרונות הרזולוציה של מודל bilayers שומנים מישוריים עם המורכבות וdeformability של נגמ&quot;שים מקצועיים הפיזיולוגיים פותחה (איור 1). איור 2 מספק דוגמאות של הגירה טיפוסית, שטף סידן ודינמיקה טופולוגית נצפתה עם זה גִישָׁה. בהעדר SAG על האנדותל, לימפוציטים מסוג CD4 + Th1 SAG ספציפי התפשט במהירות, ולקטב רוחבי להעביר על פני האנדותל (איור 2 א) בלי fluxing סידן (לא מוצג). בתוך ~ 5-10 דקות הלימפוציטים אלה ליזום גלגול על פני האנדותל. בנוכחות טעינת SAG על האנדותל, לימפוציטים מסוג להתפשט באופן סימטרי עם טופולוגיה &#39;ביצה מטוגנת &quot;, ליזום ספג (כלומר, במשך 30-60 דקות) שטף סידן תוך תאי (איור 2; סרט 1) שבמהלך הזמן הם מפגיניםהגירה קטנה או לא (איור 2 ג). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig2.jpg" /> ניתוח 2. Live- תא איור של הפעלת תאי T ופנלי הגירה והחיסונית סינפסה טופולוגיה של האנדותל נגמ&quot;שים. (א) להראות דוגמא של הדמיה בזמן סדרה של נדידת תאי T על האנדותל בהעדר לשקוע. פנל עליון מראה תמונות דסק&quot;ש. העמדה הראשונית של תאי T הנודדים מצויינים על ידי הקו המקווקו האדום. פנל תחתון מציג נקיקים נוצרו על ידי האנדותל של תא T ההגירה. חצים מצביעים על היווצרות של טבעות חולפות (~ 0.5-1 מיקרומטר קוטר) של הקרינה הקרום-YFP נוצרו כתוצאה של דור תא T של &quot;בליטות כמו invadosome-&#39;(ILPs) נגד פני השטח APC אנדותל (ראה ד&#39;). (ב) מציג דוגמא של סדרה דומה בנוכחות האנדותל טעון SAG (משמאל; ראה גםמתאים סרט 1) ועקבות הכמותית של השינויים הדינמיים ברמות סידן (מימין). חצים מצביעים על היווצרות ראשונית ILPs שבקורלציה עם החניכה של שטף סידן (אני) והייצוב הבא של ILPs מרובה שבקורלציה עם שטף סידן גבוה (ii). ניסויים (C) כמו בA ו- B היו נתונים לתא ניתוח מעקב. תמונות דסק&quot;ש על נתיבי נדידת תאי T נציג תכנית נשאר משך 10 דקות (עקבות אדומות). גרף מימין מציג את מהירויות הגירה המחושבת בהעדר הנוכחות של SAG. (ד) ניתוח דינמי של טופולוגיית סינפסה החיסונית (שונה מ -19). סכמטי (i) ממחיש תא האנדותל / &#39;מערכת טופולוגיה הכתב&#39; רגישה APC המורכב מ- ממוקדת קרום-YFP וRFP cytosolic המסיס. ILP תיווך אקטין שיבלטו לתוך שטח התא האנדותל ליצור נקיקים גליליים (סוג של רגל-הדפסה סלולרית, המכונה &#39;podo-הדפסה &quot;) גרםעלייה ששכב לקרום חד כפוף המופיעות כטבעות של הקרינה הקרום-YFP (כלומר, הקירות של הגליל נצפה en פנים). עקירת cytosol והדרה בלוקוסים אלה מופיעים עיגולים כהים כמו של RFP cytosolic. דסק&quot;ש ותמונות הקרינה ב( ii) להראות דוגמא לניתוח כזה בנוכחות SAG (ראה גם מתאים סרט 2). Podo-הדפסה ראשונית יחידה / ILP מתפתח למערך של&gt; 20 התייצבו ILPs מעל 15 דקות. קופסא הכחולה ב 15 דקות (iii) ממחישה תצוגה ברזולוציה גבוהה של podo-הדפסה / ILP אחת לפי טבעת של הקרום-YFP חופפת עם אזור של RFP cytosolic נכלל במחקר. קו מקווקו (iv) מראה סריקה וניתוח כמותי של קו עוצמות הקרינה. ברים סולם = 5 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כפי שנקבע בעבר, לימפוציטים Activהבדיקה איליי פני השטח של האנדותל ידי אקטין הארכה וHS1 (homologue cortactin) -enriched וWASp- ובליטות src תלוי כינו &quot;בליטות כמו invadosome-; (ILPs; כל ~ 0.5-1 מיקרומטר בעומק בקוטר) 27,28. Transfection חלבון הקרינה ממוקד-קרום (FP) של הודגם לספק כתבים רגישים מאוד לדינמיקה טופולוגית subcellular במשטחי תאי תאים. בדרך זו, זה כבר הראה כי טבעות בהירות של קרום-FP ניאון מעידות על קרום הכיפוף במהלך האינטראקציה תא-אנדותל T כתוצאה מבליטות ILPs תא T. הוא מוצג כאן, ובמחקרים קודמים 19,20, שבעוד שקבוצות קטנות של טופס ILPs ומחזור במהירות (כלומר, חיים של ~ 10-30 שניות) בהגירה לרוחב של תאי T על האנדותל בהעדר SAG (איור 2 א ), הם הופכים התייצבו מאוד (כלומר, חיים של ~ 30 דקות) ולצבור למערכים צפופים בנוכחותשל SAG (איור 2). יתר על כן, ניתוח של ILPs וקינטיקה ייזום סידן (&quot;קיזוז זמן&quot;) מראה כי ILPs להקדים איתות סידן, מה שמרמז שהם לסייע בתהליך הכרת MHC-II / Ag (איור 2Bii). בנוסף, התייצב מערכי ILPs טופס אחד עם שטף סידן מקסימאלי (איור 2Bii). הרעיון שהטבעות של הקרינה הקרום מתאימות לבליטות תא T נהיגה כתמי invagination בדידים בנגמ&quot;שים אנדותל, אושר על ידי ההפגנה שטבעות אלה בכל המקרים לתאם מרחבית וkinetically עם אזורים של ציטופלסמה נעקרה / לא נכללה (כפי שדווח על ידי DsRed מסיסה; איור 2 ד והסרט 2). איור 3 מספק דוגמאות של מחקרי הדמיה confocal נקודת סיום קבוע. לאחר 10 דקות של שיתוף דגירה בנוכחות SAG, ISS נוצרה בין תאי T ונגמ&quot;שים אנדותל היה צילם על ידי קיבוע, אניצביעת mmuno הקרינה ומיקרוסקופיה confocal. מחקרים אלה מספקים ניתוח של דינמיקת הפצת subcellular של מולקולות קריטיות ופעילויות איתות בתוך תחנת החלל הבינלאומית ביחס מסוימים לILPs. הכרה, הצגת אנטיגן /; במיוחד, cytoskeletal / רגולטור cytoskeletal (איור 3 א אקטין, HS1); הידבקות (CD3 / MHC-II איור 3) (ICAM-1, LFA-1, תלין; איור 3 ג), ואיתות אנטיגני (PKC -q; איור 3D) נראה ששיתוף מועשר בpodo-הדפסים / ILP. שחזור דיגיטלי של Z- ערימות סידורי-סעיף confocal מספק ראיות משלימות לאלה שמוצגים באיור 2 ד שאנדותל תא אנדותל T היא שארכיטקטורה בדידה 3-ממד מלווה ILP תא T הבולט בשטח APC (איור 3Aii, Ci, iii, ד). (איור 3Civ). <img alt="איור 3" src= &quot;/ קבצים / ftp_upload / 53,288 / 53288fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. ניתוח קבוע לדוגמא של Dynamics הפצה המולקולרי בסינפסות חיסוניות תא תא האנדותל T. ימפוציטים הודגרו על האנדותל טעון לשקוע למשך 30 דקות וקבועות ומוכתמים. בלוחות הצביעו תא האנדותל היו transfected מראש להביע קרום-YFP או -DsRed. אקטין הצג הדמיה נציג (i) וHS1 (א) (homologue cortactin; ii) שיתוף מועשר-בפריפריה של סינפסה החיסונית במייקרו-אשכולות שלתאם עם מרכז טבעות אנדותל ניאון של הקרום-YFP (כלומר, &#39; podo-הדפסים &#39;; ראו איור 2 ד) המאשר כי ILPs תא T אחראי למראה של podo-הדפסים. מבט מצד (ii. 90 ° הקרנה) ממחיש שILPs מייצג בליטת 3 ממדים במטוס ההדמיה Z (שונה מ -19). העשרת נציג של התא TCR T (i) וendoth (ב)elial MHC-II (ii) בסינפסה החיסונית, להראות מחיצות subcellular דיסקרטיות לILP / podo-ההדפסים. (ג) (i) שיתוף העשרת נציג של ICAM-1 וLFA-1 בpodo-הדפסים וILP, בהתאמה של IS. (I) מציג שחזור דיגיטלי 3-D סעיפים confocal של מסובב 60 מעלות (לוחות העליונים) ו -90 מעלות (תצוגה מאונך; לוחות נמוכים). (Ii) מציג תצוגה מוגדלת של IS en פנים. (Iii) מציג מבט חתך מאונך של האזור התאגרף ב( ii) (שונה מ -19). (Iv) שיתוף העשרת נציג תלין (חלבון מקשר integtin / אקטין) ותקטין ב היא ILPs. (ד) שיתוף העשרת נציג של TCR PKC-Q מולקולת איתות עם אקטין ב היא ILPs. כל פנל מציג en פנים נוף (חלק שמאלי תחתון) ושתי השקפות שונות המאונכות (90 ° הקרנה). לוחות שמאל קיצוני וימין השימוש הן משכפל של, הלוחות השכנים שלהם, צפוי באמצעות fluorescenc קשתבקנה מידה אינטנסיביות דואר (שונה מ -19). ברים סולם = 5 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288movie1.mov">Live- תא הדמיה דינמית של איתות סידן תא T והחיסונית סינפסה טופולוגיה: סרט 1.</a> Live- תא הדמיה זמן לשגות של הלימפוציטים מסוג CD4 + Th1 הטעון Fura2 אינטראקציה עם האנדותל מבטא קרום-YFP ועמוס SAG, מתאים לאיור 2b. לוח שמאלי מציג רמות תאיות סידן (קשת: צבעים מגניבים, סידן נמוך; צבעים חמים גבוה של סידן) בתא T. פנל ימני הקרינה הקרום-YFP מוצג על פני השטח של APC אנדותל. לימפוציטים נראים ליזום הפצה והיווצרות ILP (כפי שניתן לראות דרך טבעות ניאון בערוץ ממ-YFP; כלומר, &#39;podo-הדפסים&#39;; ראו איור 2Bi), ואחריו אינדוקציה של שטף מתמשך (30-60 דקות) תאית סידן, אשר מתרחש בקנה אחד עם היווצרות של מערכים היקפיים של ILPs / podo-הדפסים מקבילים לTCR / אקטין &#39;איתות-התקבצו מיקרו&#39; כי הם ראו בדגמי APC bilayer מישוריים (ראה איור 2Bii). המרווח בין המסגרות הוא 20 שניות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/Movie1_finale_02_18_15.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/53288/53288movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/53288movie2.mov">סרט 2: Live- תא הדמיה דינמית של אימונולוגי סינפסה טופולוגיה vi</a>כתבי ניאון בהאנדותל נגמ&quot;שים. Live- תא הדמיה זמן לשגות של הלימפוציטים מסוג CD4 + Th1 (DIC, משמאל) באינטראקציה עם האנדותל שיתוף להביע קרום-YFP (ירוק) ומסיס cytosolic DsRed (אדום) ועמוסים SAG, מתאים ל איור 2 ד. פנל ימני מראה מיזוג של דסק&quot;ש, קרום ואיתות ציטופלסמה. האותות המשולבים של קרום וקרינת cytoplasmic רגישות לדווח היווצרות ושיפוץ של מספר ~ .2-1 נקיקי מיקרומטר בקנה מידה פני השטח (podo-הדפסים) הנובעים מתא T מערכי חיטוט עם בליטות ILP. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53288/Movie2_finale_02_18_15.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics at JoVE.com

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

an-endothelial-planar-cell-model-for-imaging-immunological-synapse

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Views.  Harvard Medical School - BIDMC. Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Video: An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Biology

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Neuroscience

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...