Name: generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis at JoVE.com

עבודה זו הייתה supportedby האמריקאי למלחמה בסרטן אגודת מחקר החוקרים גרנט (RSG-12-148-01-DDC) ופרס CIRM יסוד הביולוגיה (RB4-05779).

פרוטוקול העור האנושי נערך בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קליפורניה, ועדת האתיקה של המחקר בסן דייגו. ניתן להשיג עור אדם מדגימות כירורגית שהושלכו או שנרכש מבנקי עור (בנק עור נזכר בטבלת חומר / ציוד). המיקום שבו העור נגזר מאו גיל של התורם אינו קריטי לניסוי עוד חלבוני אזור קרום במרתף (קולגן / laminin) בדרמיס אינם מושפלים. 1. הכנת עור אדם חסר חיוניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קבלת עור אנושי, הנח את הרקמה בשכונה תרביות הרקמה להפשיר (~ 3-5 דקות). בהתאם לגודל של העור, רקמות למקם מופשרים בצינור סטרילי חד פעמי 50 מיליליטר חרוטי או 125 מיליליטר בקבוק. הגודל האופייני של עור מבנק העור הוא 0.75 מ&quot;ר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המכל 75% מלאים עם פניצילין וסטרפטומיצין 4x (עט / סטרפטוקוקוס) ב1x PBS. לנער במרץ לדקות ו -5 להיפטר מהנוזלים. חזור על פעולה זו 3 פעמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הרקמה לצינור / בקבוק חדש ולהוסיף 4x הטרי עט / סטרפטוקוקוס / PBS למלא 75% מהמכל. דגירה את התערובת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות כדי לאפשר את ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטריליים, להשתמש במלקחיים כדי לקלף את העור מהעור. הדרמיס הוא לבן לחלוטין תוך האפידרמיס יהיה צביעה בהתאם לגזע של התורם (איור 1 א). מחק את האפידרמיס על פי הפרוטוקול של המוסד לטיפול ברקמות אנושיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העור בצינור או בקבוק ולשטוף אותו בעט / סטרפטוקוקוס 4x המדולל ב1x PBS עם טלטול נמרץ (5 שטיפות דקות ל4 פעמים). לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הדרמיס לצינור / בקבוק חדש ב4x העט / סטרפטוקוקוס בדילול המלא 1x PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. ניתן לאחסן הדרמיס על 4 מעלות צלזיוס עד שנה. </li></ol&gt; 2. גנטי שינוי קרטינוציטים הערה: תאי פניקס amphotropic שימוש גדלו בתקשורת DMEM המלאה [DMEM + 10% בסרום שור (FBS) + עט / סטרפטוקוקוס העוברי] לייצר וירוסים להדביק קרטינוציטים אדם עיקריים. גני האריזה ויראלי, מקודדי חלבונים כגון איסור פרסום-Pol ומעטפה משולבים ביציבות לתוך הגנום של תאי הפניקס המאפשר לייצור וירוס כאשר transfected עם וקטור retroviral. ניתן transfected תאי פניקס עם יעילות גבוהה המאפשרת ייצור כייל נגיף גבוה. וירוס המופק מקו אריזה זה יכול להדביק גם מגוון גדול של תאי יונקים, כולל אדם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: היום לפני transfection, תאי זרע פניקס בצלחת 6-גם בצפיפות של 800,000 תאים לכל גם בתקשורת DMEM מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: יום transfection, להשתמש בכל טוב 3 מיקרוגרם של וקטורי retroviral. Aliquot 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral לתוך צינור 1.5 מיליליטר. להשתמש בשילוב של 100 μ; L DMEM בתוספת 6 μl של מגיב transfection לכל 3 מיקרוגרם של וקטור. מערבבים 6 μl של מגיב transfection עם 100 DMEM μl בצינור 1.5 מיליליטר. (וקטורי retroviral המשמשים מפורטים בטבלת ציוד / חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות ומוסיפים את תערובת 106 μl לתוך הצינור מראש aliquoted המכיל 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral. לערבב דגירה על RT למשך 30 דקות. להוסיף כל dropwise את התערובת היטב בכל תאי הפניקס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: היום לאחר transfection, להסיר את המדיה מתאי הפניקס ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה הטרי. באותו היום, זרע קרטינוציטים אדם עיקריים ל6-גם צלחות בצפיפות של 75,000 תאים בכל טוב. לשמור על קרטינוציטים במדיום סרום keratinocyte חופשי (KCSFM) עם אנטיביוטיקה (עט / סטרפטוקוקוס). הערה: קרטינוציטים אדם יסודיים נרכשו. ניתן לרכוש תאים ממגוון רחב של ספקים (המפורט בטבלת חומר / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4: הריבשילו התקשורת מתאי פניקס transfected, אשר כעת מכילים חלקיקים נגיפיים. להעביר את התקשורת באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק (כדי להסיר את כל תאי פניקס זיהום) ומקום 2 מיליליטר על קרטינוציטים (מצופים ב75,000 תאים / גם היום קודם לכן: ראה שלב 2.3). להוסיף ברומיד hexadimethrine (5 מיקרוגרם / מיליליטר) לתקשורת כדי לעזור לתווך בתהליך ההדבקה. titers ויראלי הם ~ 1 x 10 7 TU / מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 6 הצלחות גם בצנטריפוגה XG 200 עבור שעה 1 ב RT. אחרי הספין, להסיר את המדיה המכילה וירוס ולשטוף את התאים פעם עם PBS 1x לפני הוספת KCSFM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5: להדביק אותו אצווה של קרטינוציטים שוב כמו בשלב 2.4. הערה: בחר את קרטינוציטים באמצעות תרופה אם יש סמן לבחירה על וקטור retroviral ולהרחיב לשימוש בניתוח או יישומים כגון תרבויות organotypic במורד הזרם. </li></ol> 3. הגדרת תרבויות עור Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנותקלטת organotypic מחומרים נפוצים שנמצאו במעבדה או הקלטות יכולה להיות מותאמת אישית עשתה דרך חנות ייצור מתכת (איור 2 א - ו). כדי להפוך קלטות אלה מצלחת תרבית רקמת 3.5 סנטימטר, להשתמש כויה להסיר כיכר 1.0 סנטימטרים X 1.0 סנטימטר ממרכז המכסה של צלחת 3.5 סנטימטר (איור 2 א-ב). האם זה בתנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף יתדות כיכר לחלק התחתון של הקלטת (מכסה של 3.5 מנה סנטימטרים) באמצעות פולני ברור מסמר (איור 2 ג). לאפשר 5 דקות ללק להתייבש ולהפוך את הקלטת על כך שהוא מונח על היתדות מרובעות (איור 2 ד). מניחים את הקלטת לתוך צלחת 6 סנטימטר. הערה: כיכר יתדות ניתן לרכוש ממגוון רחב של אומנויות ומלאכות חנויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדיום גידול keratinocyte (קג&quot;מ) היווה 66% DMEM, 22% F12 של בשר חזיר, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 10% FBS, 2.67 מיקרוגרם / מיליליטר אדנין, 40 ng / ml הידרוקורטיזון, 10 רעל ng / ml כולרה, 4.94 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 1.36 ng / ml Triiodo-L-thyronine, 10 ng / ml EGF, ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר hydrochloride ציפרופלוקסצין. סנן את התקשורת דרך מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הדרמיס מתוך העט / סטרפטוקוקוס 4x + פתרון PBS ולשטוף 2 פעמים בקג&quot;מ ואז דגירה בקג&quot;מ ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור באמצעות אזמל 1.5 סנטימטרים X 1.5 סנטימטר חתיכות בגודל ולאחר מכן למקם על גבי קלטת organotypic. מניחים את העור עם החלק העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה. חלקיו העליונים של הדרמיס יהיה הצד שבא במגע עם קרטינוציטים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העור החתוך מראש על החור המרובע של קלטת organotypic עם הצד העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הקלטת כל organotypic מכילה הדרמיס על שימוש במלקחיים (איור 3). להפשיר את פתרון מטריקס על קרח. שימוש במחט ומזרק לצייר מתוך פתרון מטריקס לקלטת 100 μl. הוסף 5 טיפות לתחתית של הדרמיס (צד מבריק) ולנער מעט כדי להבטיח אפילו הפצה ברחבי הדרמיס (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 5 דקות לפתרון מטריצה ​​סלולרית נוסף המסחרי לביסוס לחלוטין (איור 3 ג). לאחר התמצקות, להשתמש במלקחיים כדי להעיף את הקלטת בחזרה מעל. הוסף 4 מיליליטר של קג&quot;מ לצלחת 6 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 0.5-1,000,000 קרטינוציטים מהונדסים גנטי על קלטות organotypic מכילות הדרמיס (איור 3D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize קרטינוציטים על ידי הצבת 4 מיליליטר של 0.05% טריפסין על צלחות 10 סנטימטרים למשך 5 דקות ולהרוות עם 4 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן קרטינוציטים באמצעות hemocytometer ואז ספין למטה XG 200 במשך 5 דקות. תאי .5-1,000,000 גלולים (תלוי במספר התאים הזמינים) ב -90 μl של קג&quot;מ ולמקם את כל התאים על גבי העור. הערה: חשוב לשים את אותו המספר של תאים בדרמיס באותו הניסוי על מנת להבטיח כי כל הבדלים ראו בעובי של האפידרמיס מחדש הוא לא בשל הבדלים במתחילים מספר תא. הצבה פחות מ -0.5 מיליון תאים בדרמיס יכול להוביל לריבוד ובידול העניים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תקשורת קג&quot;מ בתרבויות organotypic בכל יום אחר. רקמת קציר 1-14 ימים לאחר ההנפקה של קרטינוציטים בדרמיס. ריבוד ובידול מלא של האפידרמיס מתרחש בדרך כלל לאחר היום 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Tadeu, A. M., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells+in+adult+skin.">Epithelial stem cells in adult skin.</a> Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).</li><li>Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+one's+identity:+the+epigenetic+basis+of+stem+cell+fate+decisions.">Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions.</a> FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).</li><li>Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+barrier+formation+and+recovery+in+skin+disorders.">Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders.</a> J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).</li><li>Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+function+in+epidermis.">Transglutaminase function in epidermis.</a> J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).</li><li>Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pathways+in+disorders+of+epidermal+differentiation.">Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation.</a> Trends Genet. 29, 31-40 (2013).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+differentiation:+the+bare+essentials.">Epidermal differentiation: the bare essentials.</a> J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).</li><li>Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+human+skin+tissue.">Modelling cancer in human skin tissue.</a> Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).</li><li>Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organotypic+culture+of+human+skin+keratinocytes+and+fibroblasts+to+achieve+form+and+function.">The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.</a> Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).</li><li>Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+skin+culture.">Organotypic skin culture.</a> J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).</li><li>Sen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZNF750+Is+a+p63+Target+Gene+that+Induces+KLF4+to+Drive+Terminal+Epidermal+Differentiation.">ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation.</a> Dev Cell. 22, 669-677 (2012).</li><li>Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+differentiation+in+a+self-renewing+mammalian+tissue+by+the+histone+demethylase+JMJD3.">Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3.</a> Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAI2+controls+the+undifferentiated+state+of+human+epidermal+progenitor+cells.">SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells.</a> Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).</li><li>Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+regulates+proliferation+and+differentiation+of+developmentally+mature+keratinocytes.">p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes.</a> Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493, 231-235 (2013).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+function+in+self-renewing+human+epidermis+is+maintained+by+the+exosome.">Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome.</a> Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+progenitor+differentiation+requires+the+long+noncoding+RNA+ANCR.">Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR.</a> Genes Dev. 26, 338-343 (2012).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).</li><li>Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZNF750+interacts+with+KLF4+and+RCOR1,+KDM1A,+and+CTBP1/2+chromatin+regulators+to+repress+epidermal+progenitor+genes+and+induce+differentiation+genes.">ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes.</a> Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).</li><li>Jameson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IQGAP1+scaffold-kinase+interaction+blockade+selectively+targets+RAS-MAP+kinase-driven+tumors.">IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors.</a> Nat Med. 19, 626-630 (2013).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+SNAI2+regulated+genes+in+primary+human+keratinocytes.">Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes.</a> Genomics data. 4, 43-46 (2015).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Doebis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+epithelial+cells+and+keratinocytes+with+improved+adenoviral+gene+transfer+for+the+application+in+skin+tissue+engineering.">Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering.</a> Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).</li><li>Melo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+correction+of+junctional+epidermolysis+bullosa+by+a+highly+recombinogenic+AAV+variant.">Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant.</a> Mol Ther. 22, 725-733 (2014).</li><li>Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expansion+of+human+keratinocyte+stem/progenitor+cells+carrying+a+transgene+with+lentiviral+vector.">Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector.</a> Stem cell res ther. 4, 127 (2013).</li><li>Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+maintains+progenitor+function+in+self-renewing+somatic+tissue.">DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue.</a> Nature. 463, 563-567 (2010).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li><li>Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+skin:+fibroblasts+facilitate+keratinocyte+growth+and+differentiation+on+acellular+reticular+dermis.">In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis.</a> J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).</li></ol>

We have nothing to disclose.

מניפולציה גנטית בעור אנושי תרבויות organotypic מציעות יתרונות רבים ללמדה נפוצה 2D תאים בתרבית וכן מודלים של עכברים. תרבויות 2D חסרות שלוש אינטראקציות מטריצת ממדי תא-תא ותא-תאי נמצאות ברקמות ואיברים שלמים. גם מחקרים שנעשו לאחרונה מצאו הבדלים עצומים בין תאי סרטן העור תרבותיי...

האפידרמיס האנושי הוא אפיתל מרובדת המתחבר לדרמיס הבסיס באמצעות מטריקס הידוע כהאפידרמיס zone.The הקרום במרתף לא רק משמש כמחסום בלתי חדיר כדי למנוע אובדן הלחות, אלא גם כקו הגנה ראשון כדי להגן על גוף מחומרים זרים ורעילים 1. שכבת הבסיס, המהווה את השכבה העמוקה ביותר של האפידרמיס, מכילה תאי גזע אפידרמיס ואב שיוצרים צאצאים המובחנים שמהווים את שאר האפידרמיס 2. כתאי אפידרמיס להבדיל הם נודדים כלפי מעלה כדי ליצור את השכבה הראשונה של תאים מובחנים הידועים כשכבת spinous 3. בשכבת spinous, תאים להפעיל את הביטוי של keratins 1 ו -10, אשר לאחר מכן לספק הכוח לעמוד בפני לחץ פיזי לשכבות מובחנות של האפידרמיס. כתאי שכבת spinous נוספים להבדיל, הם עוברים כלפי מעלה באפידרמיס למ &#39;שכבת גרגרים אשר מאופיינת על ידי ההיווצרות של גרגרי keratohyalin ושבשבת כמו גם חלבונים מבניים שהם התאספו מתחת קרום הפלזמה. כמו התאים להמשיך בתהליך ההתמיינות, החלבונים מתחת קרום הפלזמה הם צלב מקושרים זה לזה בזמן שגרגרי שבשבת נמתחים מהתאים ליצירת שומנים מחסום עשיר נקרא השכבה קרנית 4. מחלות שקשורים לשינויים בצמיחת אפידרמיס והשפעת בידול ~ 20% מהאוכלוסייה 5. לפיכך, הבנת המנגנונים של תהליך זה היא בעל חשיבות רבה. מאז גילוים של רבים ממחלות אלה מותנה קשר תאי תאים או תא-מטריקס, תרבויות organotypic בי האפידרמיס האנושי מחדש בסביבת 3D נוצרו 6-10. שיטות אלו בדרך כלל כרוכות בשימוש בקרטינוציטים ראשוניים או הפכו זרע על מטריקס כגון אדם חסר חיוניותדרמיס, Matrigel, או קולגן. כדי להבין את מנגנוני רגולציה גן שהם חשובים בגדילה באפידרמיס ובידול, ניתן להשפיע קרטינוציטים גנטיים באמצעות וקטורי retroviral למציאה או ביטוי יתר הגנים בתרבות 2D ולאחר מכן מחדש ב3D. שיטות אלה היו בשימוש נרחב כדי לאפיין את הגנים מעורבים בגזע אפידרמיס והתחדשות עצמית תא אב ובידול, כמו גם התקדמות לגידולים 11-21. כאן, פרוטוקול מעמיק על איך לשנות ביטוי גנים בתרבויות organotypic אפידרמיס באמצעות רטרווירוסים מסופק.

<table><tbody><tr><td>Human skin</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&quot;&gt;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amphotropic phoenix cell lines</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td><td>Serologicals</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>cautery</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 antibody</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>square pegs</td><td>Arts and crafts stores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>Cell Applications</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV retroviral vector</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS retroviral vector</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Retroviral vector</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis

תרבויות organotypic לאפשר הכינון מחדש של סביבת 3D קריטית עבור אינטראקציות מגע תאי תאים ותא-מטריצה ​​אשר מחקה את הפונקציה ופיזיולוגיה של עמיתיהם בvivo רקמה. זה בא לידי ביטוי על ידי תרבויות עור organotypic שנאמנות מסכמת את בידול אפידרמיס ותכנית ריבוד. קרטינוציטים אפידרמיס אנושיים עיקריים הם גנטי מניפולציה באמצעות רטרווירוסים שבו ניתן ביטוי יתר בקלות או הפילו את הגנים. קרטינוציטים מהונדסים גנטי אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להתחדש האפידרמיס אנושי בתרבויות עור organotypic מתן מודל רב עוצמה כדי לחקור מסלולים גנטיים צמיחה להשפיע אפידרמיס, בידול, והתקדמות מחלה. הפרוטוקולים שהוצגו כאן לתאר שיטות להכנת עור אנושי חסר חיוניות, כמו גם לבחינה גנטית לתפעל קרטינוציטים אדם ראשיים, במטרה ליצור תרבויות עור organotypic. עור אדם מחדש ניתן להשתמש בdownstrיישומי EAM כגון פרופיל ביטוי גנים, immunostaining, וimmunoprecipitations הכרומטין אחרי רצף תפוקה גבוה. כך, דור של תרבויות עור organotypic אלה מהונדסים גנטיים יאפשר הקביעה של גנים שהם קריטיים לשמירה על הומאוסטזיס עור.

הצעד הראשון ביצירת העור אנושי organotypic הוא להסיר את העור מהעור. הדגירה של השבועיים של העור על 37 מעלות צלזיוס ב4x העט / סטרפטוקוקוס / PBS צריכה לאפשר ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס (איור 1 א). אם מפריד את האפידרמיס והדרמיס הוא קשה ואז למקם את הרקמה על 37 מעלות צלזיוס בעט / ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis at JoVE.com

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K Views.  UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego. The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. 

Video: Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Cancer Research

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioengineering

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

סקירה מקיפה של פרוטוקולי תרבית צמחילת עור עוברי בעופות

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

מחבר זרקור: תובנה לגבי המתודולוגיות הניסיוניות הנוכחיות של צמחי עור העופות

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

דור של שווה ערך לעור אנושי בהרכבה עצמית

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

עור 2D and 3D שיפור

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

דור של שווה ערך לעור אנושי בהרכבה עצמית