Name: isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

NGL נתמכה על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. אנו בתודה להכיר מורין McGerty ואיימי א Furcron (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית שלהם של כתב היד.

המחברים לחשוף אין ניגודי אינטרסים.

איסוף נתונים עקביים שמתעד את מאפייני השפע ופנוטיפי של לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי הוא חיוני להבנת הפתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון. כמה טכניקות תוארו המאפשרות הבידוד של חדירה לויקוציטים מהרקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי במהלך הריון 31,38,39,43-46. עם זאת, כל טכניקה היא שונה, שימושים שונים אנזימים או שילובי אנזים, דורש פעמים ניתוק שונות, אינו מציין כמויות של רקמה, והכי חשוב, לא תמיד לציין את הכדאיות של התאים המבודדים. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר הבידוד של חדירה לויקוציטים מהרקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי עם כדאיות גבוהה, ומספק מידע מפורט על חומרים כימיים המסחריים, הכנת חיץ, כמויות רקמה, ופעמים דגירה תוקף במעבדה. אחד השלבים הקריטיים ביותר בתהליך בידוד יקוציט הוא ניתוק הרקמות; צעד זה כרוך הומוגניזציה מכאנית ו / או תגובות אנזימטיות שיכול לשנות את השלמות של חלבונים תאיים המשמשים באפיון פנוטיפי 47. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מציע גישה חדשנית המשלבת את השימוש בטכניקות ניתוק רקמה מכאניות והאנזימטית עדינות לשמור על השלמות של סמנים תאיים בלויקוציטים מבודד מהשלייה ורקמות decidual ורחם של עכברים. אנזימים ושילובים של אנזימים שונים אחת שימשו לבודד את כדוריות דם לבנות שחדרו מהרקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי 31,32,39,44. במקרים רבים, אנזימים אלה כי הם מוכנים לריכוזים ספציפיים ביד במעבדה עשויים להיות כפופים לטעויות אנוש. כאן, במקום, collagenase המטוהר / prot ניטראלי מוכן לשימושלהקל קוקטייל, Accutase, יושם במעבדה; כהכנת אנזים זמינה מסחרי, זה הוכח כדי לספק תוצאות אמינות בתא התרבות 48. פתרון האנזימטית זה ידוע ביעילות לנתק מקרופאגים מהצלחות התרבות ללא גירוד, והכי חשוב, מבלי לאבד את פני השטח אנטיגנים 48. אנזים מוכן זה שימש גם כדי לעבד את העיכול של רקמות מערכת עצבים אדם ובעלי חיים, וכתוצאה מכך תאים מבודדים קיימא שנותרו קיימא לתקופות ארוכות, המאפשר התרבות הבאה שלהם 47. יתר על כן, פתרון זה שומר האנזימטית antigenicity CD24 בתאים מבודדים מרקמות מערכת עצבים מרכזיות 47. בהשוואה לLiberase-1, קוקטייל אחר של collagenase ופרוטאז הניטרלי, לא Accutase לא Liberase-1 ליצור אגרגטים DNA חופשיים; עם זאת, Accutase הוא עדין יותר Liberase-1 במהלך ניתוק רקמה 47. Collagenase / שיתוף פרוטאז הניטרליcktail שימוש בפרוטוקול זה גם הוכיח עליונות לטריפסין בשימור CD44, סמן פני תא גזע סרטני 49. המחקרים של מעבדה זו ציינו באופן עקבי כי פתרון האנזימטית זה שומר אנטיגנים משטח יקוציט עכבר. תאים אכן, הבדלים אינפורמטיבי כבר נמצאו בביטוי של סמנים תאיים במקרופאגים (CD11b + F4 / 80 + תאים), נויטרופילים (CD11b + Ly6G + תאים), NKT (CD3 + CD49b + תאים), תאי T (CD3 + תאים) ו- B תאים (B220 + CD19 + תאים), כולל CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, וCTLA4, ובשחרור ציטוקינים. לכן, השיטה המתוארת במסמך זה היא אופטימלית עבור immunophenotyping של חדירה לויקוציטים בממשק האימהי-עוברי בעכברים, כפי שמוצג בתוצאות הנציג. יתרון חשוב אחד של שיטה זו הוא הקביעה בו זמנית של מספר אנטיגנים תאיים ו תאיים בתוך שער הכדאיות. הצבע ביותר המשמש לדהכדאיות תא termine היא יודיד propidium (PI); עם זאת, השימוש בו מוגבל שכן הוא יכול לשמש רק בשילוב עם FITC. הסיבה לכך הוא PI לא ניתן להבחין במידה מספקת מרוב fluorochromes האחר התלהב מלייזרים כחולים ואדומים 50. פתרון הוא להשתמש DAPI 50 או כל צבע אחר שמתלהב מלייזרי UV אבל לא על ידי לייזרים כחולים ואדום המשמשים בדרך כלל לimmunophenotyping. פרוטוקול זה מאפשר immunophenotyping של תאי קיימא כפי שכולל את השימוש של 50 DAPI לתאי unfixable או השימוש בצבע כדאיות לתאים ניתן לתקן. יתרון חשוב שני של הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוא שהיא מאפשרת הבידוד של כדוריות דם לבנות עם תשואה גבוהה של תאי קיימא. נתונים הנציג מראה כי 70% עד 89% מהתאים המבודדים הם בת קיימא. זה הוא בעל חשיבות רבה כפרוטוקול זה אפשר המחקר של התכונות הפונקציונליות של התאים המבודדים מרקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי. Fאו דוגמא, תרבויות של מקרופאגים decidual והרחם והמחקר של שחרור ציטוקינים תחת גירוי בוצעו בשיטה זו. כדי להשיג תוצאות מוצלחות, היישום של הפרוטוקול המתואר הוא חשוב כאשר שוקלים את הגורמים הבאים: 1) אוסף רקמות חייב להתבצע בתוך 5 עד 10 דקות לאחר פתיחת חלל הצפק, ורקמות אלה חייבים להיות ממוקמות על קרח כדי לשמור על הכדאיות של התאים המבודדים; 2) הומוגניזציה רקמה מכאנית חייבת להתבצע באמצעות מספריים עדינים קצה ולא יעלה על 2 דקות מאז תקופות ארוכות יותר כבר הוכיחו כדי להפחית את התשואה של תאי קיימא; 3) משך הדגירה עם הפתרון האנזימטית חייב להיות פחות משעת 1 מאז פעילותה פוחתת לאחר תקופה זו; 4) בטמפרטורה של דגירה עם הפתרון האנזימטית יש לשמור על 37 מעלות צלזיוס להשיג את הפעילות האופטימלית של קוקטייל זה של אנזימים; 5) manip תא גלולהulation חייב להיעשות בעדינות עם micropipettes כי שימוש במערבולת יכולה לפגוע בשלמות של התאים (תאים מבודדים הם מניפולציה מובחנת ופתאומית בקלות יכולה להפחית את הכדאיות שלהם); 6) חיץ וטמפרטורות צנטריפוגות חייבת להישמר באותה הטמפרטורה כמו ההשעיה התא; 7) תאים מבודדים חייבים להיות מעובד לimmunophenotyping או להשתמש מייד ככדאיות שלהם מפחיתה במהירות; ו -8) בעת ביצוע immunophenotyping, דגימות חייבות להיות נרכשו באמצעות cytometer זרימה מייד לתוצאות הטובות ביותר. הגבלה של פרוטוקול זה היא העלות של הפתרון האנזימטית, שהוא יקר יותר מאנזימים אחרים עם פונקציות דומות, למשל, טריפסין, dispase השנייה, וcollagenase. עם זאת, היתרונות שפתרון האנזימטית זה מציג מעל ומעבר לאנזימים שתוארו הם מעולים. חוץ מזה immunophenotyping ותרבות תא והמיון, היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם נוmerous ומגוון. לדוגמא, ניתן כיום לקבוע מתילציה DNA, ביטוי של גני המטרה, במבחנה פונקציונלי יקוציט (מבחני לדוגמא, phagocytosis, רעילים, התפשטות תאי T וגמישות, וכו &#39;), וייצור של מיני חמצן מגיבים בלויקוציטים המבודד מרקמות עכברי בממשק העוברי האימהי. ואכן, תיאור של לויקוציטים החדש והנדיר ברקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי יכול להיות גם ביצע.

סובלנות חיסונית בהריון היא תקופה בה שינויים ייחודיים להתרחש בתוך המערכת החיסונית של האם. שינויים אלו מאפשרים לאם לעובר תסבול, שתל למחצה אלוגנאית 1. העובר מבטא מורכב histocompatibility גדול אבהי (MHC) אנטיגנים 2, ותאים עובריים כבר נמצאו במחזור הדם האימהי 3; עם זאת, העובר לא נדחה 4,5. חידה זה לא מובן לחלוטין. ההשערה האחרונה קובע כי סובלנות אימהית-עוברית נוצר במהלך משגל והפרית 6,7 ומתוחזק כדי לקיים הריון טווח מלא 8-10. פירוט של סובלנות אימהית-עוברי זה נחשב מנגנון של מחלה במהלך הריון 10-16 המוקדם ומאוחר שלבים. סובלנות האם ועובר כרוך בהשתתפות תת-אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כוללים תאי T (תאי T רגולטורים, תאי Th1, תאי Th2, ותאי TH17), מקrophages, נויטרופילים, תאי פיטום, תאי NK, ותאי NKT, תאים דנדריטים, ותאי B, ששינוי בצפיפות ולוקליזציה במהלך הריון 15,17-19. סובלנות האם ועובר מועשרת בממשק אימהי-העוברי 20 - האתר אנטומיים בי המערכת החיסונית של האם אינטראקציה עם אנטיגנים העובריים 20,21. הממשק אימהי-העוברי נוצר במהלך placentation כאשר תאי trophoblast extravillous העובריים לפלוש רירית רחם 22-24. בצד העוברי של ממשק זה, הקרומים המקיפים את העובר ליצור משטח אפיתל מיוחד בתוך השליה, ותאי syncytiotrophoblast לשלוט בבורסה התזונתית באמצעות המגע הישיר שלהם עם דם אימהי 22. בצד האימהי של הממשק, decidua מגייס בריכת הטרוגנית של לויקוציטים שבעכברים כ -30% עד 50% מכל תאי decidual. בנוסף להשתתפותם בmaternסובלנות חיסונית אל, תאים אלה הם תורמים מרכזיים לתהליכים שונים במהלך הריון, למשל., שליה ההגנה על מערכת הרבייה מזיהומים, הפריה, השרשת עובר 7,25, אנגיוגנזה decidual 26, שיפוץ כלי דם 24,27, פלישת trophoblast 28, פיתוח 24,25, וסופו של דבר, עבודה ומסירה 15,17. לכן, המחקר של לויקוציטים המעורב בסובלנות אימהית-עוברית הוא חיוני להבהרת פתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון. בעוד שהשימוש באימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence יצר נתונים להדמיה הישירה והלוקליזציה של רחם, decidual, או כדוריות דם לבנות שליה 29,30, cytometry זרימת הניתוח חשף נוסף תת ספציפי של לויקוציטים בכל אחד מרקמות אלה 31,32. בנוסף, cytometry זרימה נעשה שימוש כדי לקבוע את הצפיפות וחלקם של מאטרסופי-עוברי ממשק לויקוציטים 33 וביטוי רמות של חלבונים תאיים ו תאיים 8-10,34. ניתוח תזרים cytometric של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי דורש השעיה תא בודד. כדי לבודד לויקוציטים מסתנן מdecidual, הרחם, ורקמות שליה, שתי שיטות של ניתוק רקמה שימשו: מכאנית והאנזימטית. שני השיטות לאפשר את ההפרדה של לויקוציטים הסתנן מהמטריצה ​​תאית (ECM) של רקמות אלה. ניתוק רקמה אנזימתי עדיף על ניתוק רקמה מכאני שכן היא מאפשרת תשואה גבוהה יותר של כדוריות דם לבנות עם הנזק קשור-כוח גזירה פחות 35. כתוצאה מכך, ניתוק רקמה מכאני דורש איגום רקמות 36, אשר עשוי להגדיל את השונות וההטרוגניות של הדגימות. עם זאת, ניתוק מכאני עשוי להיות הבחירה כאשר אנטיגן של עניין ניתן לשנות על ידי ניתוק האנזימטית או כאשר פונקציונלי של התאים של צורך העניין לשימור (לדוגמא., רעיל של תאי NK) 35. השימוש בproteolysis עם אנזימים ספציפיים לבזות ECM מבטל את התשואות נמוכות שנצפו עם ניתוק מכאני. מספר מחקרים דיווחו על השימוש בטריפסין 32, collagenase 37, 31 DNase, dispase 38, וקוקטיילים מסחריים של אנזימים שונים 32,39. עם זאת, הטבע והריכוז של אנזימים שונים ואת משך הזמן של עיכול חייב להיות מוגדר בקפדנות ומאומתים על מנת להבטיח שמירה על שלמותו של אפיטופים אנטיגני פני תא הנדרשים לimmunophenotyping. מבני המשטח שונים באופן דיפרנציאלי רגישים להרס על ידי אנזימים שונים, עם כמה אנזימים, כגון טריפסין, להיות ידוע לשמצה בהפשטת epitopes משטח יקוציט מוכרת על ידי רבים נוגדנים חד-שבטיים. הציג במסמך זה הוא שיטה באמצעות proteolytIC וקוקטייל האנזימטית collagenolytic, נקרא Accutase. פתרון האנזימטית זה עדין מספיק ועדיין יעיל במתנער רקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי, ואינו דורש תוספת של חומרים כימיים מתנערים אחרים או סרום לסיים את תגובת הניתוק. יתר על כן, הוא מוכן לשימוש כפי שסופק ו, למרות שהזמן של ניתוק צריך להיות מאומת, זה יותר חזק מאשר האנזימים הנ&quot;ל 40,41. הניצול של שילוב של שני הסוגים של רקמות disaggregation משפר את האיכות וכמות התאים שהושגו; כך, מספר מחקרים יישמו את השימוש בשילוב של ניתוק מכאני והאנזימטית עם תוצאות משביעות רצון 31,32,37. הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוקם ומאומתים במעבדה שלנו; היא משתמשת בשילוב של ניתוק מכאני עדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק. פרוטוקול זה מאפשר מחקר והבידוד נוסף שללויקוציטים מסתנן ברקמות עכברית בממשק האימהי-עוברי (רחם, decidua, ושליה). הפרוטוקול הבא גם שומר על השלמות של סמנים פני תא ותשואות מספיק תאי קיימא עבור יישומים במורד הזרם כפי שהודגם על ידי ניתוח התזרים cytometric. לבסוף, פרוטוקול זה שומר על העקביות של תא הכנה לניתוח והשוואה של רקמות עכברי שונות המרכיבות את הממשק אימהי-עוברי.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Magentic Cell Separation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m pre-separation filters</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratory preparation</td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accutase enzymatic solution</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse extracellular antibodies</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Table 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability dye</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Fixation buffer solution</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>Laboratory preparation</td><td>0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0.4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum system</td><td></td><td></td><td>laboratory constructed</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubator 3307</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Precision</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td></td></tr><tr><td>Optical and fluorescence microscopes</td><td>Zeiss and Olympus</td><td>Zeiss LSM780 and Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

סובלנות חיסונית בהריון דורשת שהמערכת החיסונית של האם עוברת שינויים ייחודיים במטרה לקבל ולטפח את העובר המתפתח. סובלנות זה הוא שיזמה במהלך משגל, הוקמה במהלך הפריה וההשתלה, ונשמרה לאורך הריון. מתווכים תאיים ומולקולריים פעילים של סובלנות אימהית-עוברית מועשרים באתר של קשר בין רקמות עובריות ואימהיות, הידוע בממשק האימהי-עוברי, הכולל את השליה ורחם ורקמות decidual. ממשק זה מורכב מתאי סטרומה ולויקוציטים הסתננות, ומאפייני השפע ופנוטיפי לשנות במהלך ההריון. לויקוציטים מסתנן בממשק האימהי-עוברי כולל נויטרופילים, מקרופאגים, תאים דנדריטים, תאי פיטום, תאי T, תאי B, תאי NK, ותאי NKT שיחד יוצרים מיקרו-הסביבה המקומית המקיימת הריון. חוסר איזון בין תאים אלה או כל inappropשינוי riate בפנוטיפים שלהם נחשב למנגנון של מחלה בהריון. לכן, המחקר של לויקוציטים שלהסתנן הממשק אימהי-העוברי הוא חיוני על מנת להבהיר את מנגנוני החיסון שיובילו לסיבוכים הקשורים להריון. תאר במסמך זה הוא פרוטוקול שמשתמש בשילוב של ניתוק מכאני העדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק עם מפרקי חלבונים וקוקטייל האנזימטית collagenolytic לבודד את כדוריות דם לבנות שחדרו מהרקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי. פרוטוקול זה מאפשר הבידוד של מספרים גבוהים של כדוריות דם לבנות קיימא (&gt; 70%) עם מאפייני אנטיגני ופונקציונליים מספיק שימור. אז יכולים להיות מנותח על ידי כדוריות דם לבנות מבודדים כמה טכניקות, כולל immunophenotyping, מיון תא, הדמיה, immunoblotting, ביטוי mRNA, תרבית תאים, ובמבחני מבחנה פונקציונליים כגון תגובות מעורבות לויקוציטים, הפצה, או מבחני רעילים.

הנתיחה של רקמות עכברי מהממשק האימהי-העוברי מוצגת באיור 1; הליך זה כולל פתיחת חלל הצפק (איור 1 א &#39;, ב&#39;), קרן הרחם (איור 1 ג) כוללים אתרי ההשתלה (1D איור), והאוסף של רקמות הרחם (איור 1E), שליה (איור 1F), ורקמות decidual (איור 1G) בשעה 16.5 DPC. איור 2 מציג את המורפולוגיה של מקרופאגים המבודדים (F4 / 80 +) שנאספו מרקמות decidual ורחם ב16.5 DPC באמצעות מיון תא מגנטי. מקרופאגים מבודדים לשמור על היכולת לשחרר ציטוקינים (מידע לא מוצג). התשואה של תאי קיימא מבודדים מdecidua, הרחם, והשליה מוצגת באיור 3, וכדאיויות תא היא יותר מ -70% בכל הרקמות. איור 4 מראה את אסטרטגית gating לניתוח polymorphonucle<html> לויקוציטים ar וmononuclear בתוך singlets והשערים כדאיות, כוללים תאי T (CD45 + CD3 +), נויטרופילים (CD45 + Ly6G +), מקרופאגים (CD45 + F4 / 80 +), תאים דנדריטים (CD45 + + CD11c), ותאי NK (CD45 + CD49b +) בשעה 16.5 DPC. שיעור גבוה של מקרופאגים CD11c שיתוף מפורש. איור 5 מראה נויטרופילים, מקרופאגים, תאי T ובdecidual, הרחם, ורקמות שליה ב16.5 DPC. איור 6 מציג את אסטרטגית gating לניתוח לימפוציטים בתוך singlets והשערים כדאיות, כוללים תאי T (CD45 + CD3 +) ותאי B (CD45 + B220 +) בשעה 16.5 DPC. תאי T מסוג CD4 + כוללים תאי CD8 + T ו. רקמות עכברי בממשק אימהי-העוברי כוללות גם CD3 CD4 +-CD8- (תאי T גמא דלתא) בפרופורציות גבוהות. איור 7 מראה תאי T ותאי B בdecidual, הרחם, ורקמות שליה ב16.5 DPC. &quot;Width =&quot; 700 jpg &quot;/&gt; נתיחת איור 1. רקמות. קרן רחם () ב16.5 DPC בעכבר B6. קרנות הרחם מצורפים ללפדר וכלי ניקוז. קרנות רחם (ב) גזורים מלפדר ועדיין מחוברות לצוואר הרחם. קרנות רחם (C) כוללים אתרי ההשתלה וצוואר הרחם. Dissection (D) של אתר השתלה. Dissection (ה) של רקמות רחם מאתר ההשתלה. הפרדה (F) של השליה וdecidua מאתר ההשתלה. (G) הפלוגה של decidua (השכבה לבנה-אפורה) מהשליה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" width="500" /><html> איור 2. המקרופאגים מבודדים מרקמות decidual ורחם. המקרופאגים (F4 / 80 + תאים) מבודדים מרקמות decidual ורחם ב16.5 DPC באמצעות מיון תא מגנטי. הגדלה 20X. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3. יכולת הקיום של תאים מבודדים. תאי קיימא (תאי DAPI- מיוצגים עם חיצים) המבודדים מdecidual, רחם, ורקמות שליה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> &quot;/&gt; איור 4. אסטרטגית gating לויקוציטים polymorphonuclear וmononuclear. אוכלוסיית יקוציט סה&quot;כ הייתה מגודרת בתוך singlets והשערים כדאיות. תאי תאי T (CD45 + CD3 +), מקרופאגים (CD45 + F4 / 80 +), נויטרופילים (CD45 + Ly6G +), תאים דנדריטים (CD45 + + CD11c), וNK (CD45 + CD49b +) היו מגודר בתוך השער הכולל-יקוציט ( CD45 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg" width="600" /> תאי איור 5. נויטרופילים, מקרופאגים, תאי T ברקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי. נויטרופילים (CD45 + Ly6G +), מקרופאגים (CD45 + F4 / 80 +), ו- T (CD45 + CD3 +) היו מגודר בתוך הכדאיות וסך-יקוציט (+ CD45) שערים בdecidual המבודד, רחם, ותאי שליה.תב&quot;ע: &quot;target =&quot; _ //www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" width="600" /> תאי איור 6. אסטרטגית gating לימפוציטים. mononuclear היו מגודר בתוך singlets והשערים כדאיות. תאי T (CD3 +) ותאי B (+ B220) היו מגודר בתוך שער הכדאיות. תאי CD4 + CD8 + T והיו מגודר בשער T-cell (CD3 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" width="600" /> איור 7. תת-אוכלוסיות ימפוציטים ברקמות עכברית בממשק האימהי-עוברי. תאי T (CD3 +)ותאי B (+ B220) היו מגודר בתוך שער הכדאיות בdecidual המבודד, רחם, ותאי שליה. תאי CD4 + CD8 + T והיו מגודר בשער T-cell (CD3 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52866/52866fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> סמן תא </td><td> Fluorochrome </td><td> שיבוט </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> בשידור חי / מת </td><td> DAPI </td><td> - </td><td> חיים טכנולוגיות </td><td> L23105 </td></tr><tr><td> CD45 </td><td> V450 </td><td> 30-F11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560,501 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> FITC </td><td> 145-2C11 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553,062 </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> APC </td><td> RM4-5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553,051 </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> PE-CF594 </td><td> 53-6.7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 562,283 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> APC-Cy7 </td><td> RA3-6B2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 552,094 </td></tr><tr><td> F4 / 80 </td><td> PE </td><td> BM8 </td><td> eBiosciences </td><td> 12-4801-82 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> APC-Cy7 </td><td> 1A8 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560,600 </td></tr><tr><td> CD49b </td><td> APC </td><td> DX5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560,628 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> PE-Cy7 </td><td> HL3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 558,079 </td></tr></tbody></table> רשימת טבלת 1. נוגדנים מנוצלת לimmunophenotyping משנה לויקוציטים

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.2K Views.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Video: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Developmental Biology

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Medicine

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד של תאים חיסוניים ולא חיסוניים מריאות עכברים עבור ציטומטריית זרימה

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development of disease. Studies utilizing mouse models of respiratory infection, allergy, fibrosis, and cancer have been critical to reveal mechanisms of disease progression and identify therapeutic targets. However, most studies focused on the mouse lung prioritize the isolation of either immune cells or epithelial cells, rather than both populations concurrently. Here, we describe a method for preparing a comprehensive single-cell suspension of both immune and non-immune populations suitable for flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting. These populations include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, and a variety of myeloid cell subsets. This protocol entails bronchoalveolar lavage and subsequent inflation of the lungs with dispase. Lungs are then digested in a liberase mixture. This method of processing liberates a variety of diverse cell types and results in a single-cell suspension that does not require manual dissociation against a filter, promoting cell survival and yielding high numbers of live cells for downstream analyses. In this protocol, we also define gating schemes for epithelial and myeloid cell subsets in both na&#239;ve and influenza-infected lungs. Simultaneous isolation of live immune and non-immune cells is key for interrogating intercellular crosstalk and gaining a deeper understanding of lung biology in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

This protocol details the isolation of live immune and non-immune populations from the mouse lung at a steady state and following influenza infection. It also provides gating strategies for identifying epithelial and myeloid cell subsets.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר