Name: quantitative analysis of climbing defects in a drosophila model of neurodegenerative disorders
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders at JoVE.com

This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.

מחקר על תסיסנית melanogaster היה בעמידה באוניברסיטת הנחיות המחקר של אלברטה. 1. טוס אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20 זבובים באמצעות CO 2 הרדמה (ז) ומקום בבקבוקון אוסף 25 מ&quot;מ x 95 מ&quot;מ המכיל מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקונים המכילים חנות זבובים אופקית כדי למנוע השמנה זבובים בכל נוזלים שעלולות להצטבר בתחתית הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זבובים לפחות 21 שעות על 22 מעלות צלזיוס בלחות של 45% בחממה לכ 15 שעות. הגדר את החממה עם אור שעות 12: מחזור כהה. </li></ol> Assay 2. טיפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להעביר 20 זבובים מבקבוקון אחד לכוס 250 מיליליטר סיים גליל. לסמן את המיקום של הגליל כדי לשמור אותו קבוע כל יום. השתמש גליל זכוכית אחד לכל גנוטיפ על מנת למנוע זיהום צולב בין גנוטיפים. לשטוף בסוף כל ניסוי וroטייט בין גנוטיפים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הניסויים באור הסביבה (או אור אדום אם יש פגם פוטנציאלי בחזון) בטמפרטורה ובלחות של 22 מעלות צלזיוס ו -40% בהתאמה. כדי להימנע מלבלבל קצב היממה, תמיד לבצע ניסויים באותו הזמן של יום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החלק העליון של גליל עם סרט מכשול (סרט שעווה) כדי למנוע את בריחתו של זבובים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מצלמת וידאו על חצובה. מצלמה מתמקד בקו 190 מיליליטר של 250 מיליליטר סיימה גליל (17.5 סנטימטרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר הזבובים מתים בתחתית של הגליל ובבקבוקוני המזון. רשום את המספר הזה כתמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד קל להקיש על הגליל נגד משטח קצף תא סגור שוב ושוב עם מספיק כוח כדי לעקור את הזבובים למשטח התחתון הפנימי. הקש 5 - 10 פעמים, תוך שימוש ביד השנייה כדי ללחוץ שיא במצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;קלט&quot; את המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל vidאיו הקלטה ומצלמה ברז הגליל שש פעמים בתבנית שאינה קצבית מובהקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל כל ניסוי למשך 2 דקות מרגע שזבובי טפח אחרון ולרשום את המספר של זבובים שחצו את הגובה של 17.5 סנטימטר (190 מיליליטר) בכל נקודת זמן שנבחרה (לכמת כל 10 שניות). הערה: מיליליטר סימון על הגליל ישתנה ממודל צילינדר אחד למשנהו בהתאם לקוטר. כדי להימנע משגיאה, למדוד את הגובה על כל גליל בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמשפט הסתיים, להיפטר מהזבובים באתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.9 עד שכל משכפל נבדקו עם זבובים טריים בכל פעם. הערה: למרות 5 משכפל עשוי להיות מספיק עם מוטציה שיש השפעה חזקה על תנועה, 10 חזרות ביולוגיות של 20 זבובים (200 זבובים) מומלץ לזהות הבדלים קטנים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הניסוי, לשטוף את הגלילים במדיח הכלים במעבדה וO היבש / N לשימוש חוזר. </li></ol> 3. ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Analyקטעי וידאו של כל ze לטוס משפט. כל 10 שניות, לרשום את המספר הכולל של זבובים שעוברים את קו היעד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זבוב מטפס בחזרה למטה או נופל שיא שעפים כ-1 ו, לספור את הזבוב הבא לחצות את קו היעד אותו המספר כמו הזבוב שטיפס בחזרה למטה או נפל. לדוגמא, אם זבוב ה -15 נופל מתחת לקו המטרה, הזבוב הבא לחצות את הקו (ה -16 לטוס) נחשב זבוב ה -15 ולא ה -16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את התמותה מהמספר הכולל של זבובים (20) כדי להשיג את מספר הזבובים שנותרו במשפט. בכל נקודת זמן, לקבל את החלק היחסי של זבובים מעל קו היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה כל אחוז בכל נקודת זמן (ראה איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הביצועים בנקודת נתונים 120 שניות ולבצע מבחן t תלמיד כאשר 2 קבוצות נמצאות או ANOVA ופוסט-מבחן להשוואות מרובות (עם שינוי Bonferroni למתוכנן וTukey לשיתוף בלתי מתוכנןmparisons). קולמוגורוב-סמירנוב בדיקות 17 גם מתבצע על מנת לוודא תקינות ושונות שווה אלא גם להשוות את ההפצות של קבוצת המוטציה לשליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להציג את הנתונים על הזדקנות, עלילה אחוז של זבובים לטפס ב 120 שניות עם זבובים בגילים שונים (2 ימים, שבוע 1, 2 שבועות) כדי לראות אם יש גירעון מתקדם (איור 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila.">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila.">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li><li>Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+protein+synthesis+in+Drosophila+fragile+X+mutants+impairs+long-term+memory.">Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory.</a> Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).</li><li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+synaptic+plasticity,+courtship+behavior,+and+mushroom+body+defects+in+a+Drosophila+model+of+fragile+X+syndrome.">Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome.</a> Neuron. 45, 753-764 (2005).</li><li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+epilepsy:+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures.">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187, 523-534 (2011).</li><li>Marley, R., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+persistent+Na++current+contributes+to+seizure+in+the+slamdance+bang-sensitive+Drosophila+mutant.">Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant.</a> Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).</li><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+Mutants+Of+Drosophila+Isolated+By+Countercurrent+Distribution.">Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).</li><li>Ganetzky, B., Flanagan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+senescence+and+age-related+changes+in+two+wild-type+strains+of+Drosophila+melanogaster.">On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster.</a> Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).</li><li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+assay+Drosophila+behavior.">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+Drosophila+melanogaster+geotaxis,+a+complex+behavioral+trait.">Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait.</a> Nature genetics. 31, 349-353 (2002).</li><li>Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+simple+gravity+sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster.</a> Nature protocols. 5, 20-25 (2010).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li><li>Botella, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+carbonyl+reductase+sniffer+prevents+oxidative+stress-induced+neurodegeneration.">The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration.</a> Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Chakraborty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Drosophila+Alzheimer's+disease+model:+pharmacological+rescue+of+cognitive+defects.">Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects.</a> PLoS One. 6, e20799 (2011).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-related+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+are+ameliorated+by+treatment+with+vinblastine.">Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine.</a> J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).</li><li>Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , (2006).</li><li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function.">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429 (2004).</li><li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation.">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li><li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila.">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תסיסנית כבר הוכיחה להיות מודל מצוין ב1,2 המחלה 14 ותנאים ניווניות אחרים של פרקינסון. בנוסף לכלים הגנטיים הזמינים בדרוזופילה, הגנום שלו הוא שמור ביותר לגנים מעורבים בהפרעות נוירולוגיות 19. כניסתו של שיטות הגנום רחבות סינון גנטי (כוללים רצף exome שלם) עשויה להמשיך ולספק רשימה גדולה יותר של גנים הקשורים להפרעות מועמד תנועה אנושיות. פיתוח טיפולים לתנאים אלה יחייב מודלים של בעלי חיים כדי להגדיל את ההבנה של פתולוגיה מעורבת בשלבים המוקדמים של ניוון מוחיים השלבים שלנו. השימוש בדרוזופילה וassay geotaxis השלילי מספקת שיטה זולה ואמינה לזיהוי גנים המעורבים בפגמי קטר ולאחר מכן מסך תרופות מועמד להצלת פנוטיפ. זה מוסיף למולקולרי, אלקטרו, ולא הוכחות הדמיהניתן להשיג את הכובע באותו מודל החיה. באמצעות assay הטיפוס, אחרים לשכפל הצלחת פגמים מוטוריים במוטצית זבובים לגנים שיבוש תנועה אנושית. עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי שינויים פתולוגיים יכולים להקדים את גילוי פגמים קטר בכמה ימים 14. תופעה זו נצפתה גם בתנאים אנושיים ניווניות שבו אנחנו מדברים על שינויים תת-קליניים. אנו מאמינים כי על ידי הבנה ולאחר מכן טיפול בשינויים תת-הקליניים אלה, שינוי המחלה יהיה השתפר מאוד. אנו מציגים כאן מודל המאפשר זיהוי של פגמי תנועה קלים שעשויים לסייע בהבנת את המעבר מ&quot; presymptomatic לסימפטומטי &quot;של פתולוגיה ניווניות באמצעות מודל דרוזופילה. קבוצות רבות השתמשו במרחק טיפוס קצר (5-10 סנטימטר) אבל, הגדלנו את מרחק 17.5 סנטימטר כמו בet al Palladino. 20. למרות הבדל זהבין הגבהים טיפוס אולי נראים קלים, העלייה בגובה נועדה להגביר את קושי assay, ובכך מסייע בזיהוי פגמי טיפוס יחסית קלים. כמו כן, כמה שיטות בחרו להאיר את החלק העליון של הגליל עם מנורת סיבים אופטיים, כדי לנצל את תגובת phototaxic של מבוגר תסיסנית. עם זאת, מקור האור יכול לגרום להשתקפות אור בגליל; כך, מקור אור מפוזר מעל הניאון משמש במקום. בנוסף, מוטציה בגנים המעורבים בתהליכי ניוון מוחיים עשויה להשפיע על תפקוד העין ולכן להטות את התוצאות. הגידול בגודל המדגם 10-20 זבובים מגדיל את הכח הסטטיסטי של כל ניסוי. בתחילה, הגדלנו את המספר הזה גבוה ככל 30 זבובים, אבל זה הופחת לאחר מכן על מנת למזער את השפעות צפיפות ואינטראקציה בין זבובים. הדגימות מבוטלים לאחר שימוש אחד, ולא מתנהל במשך ארבעה חוזרים ניסויים לדגימה, כדי לחסל את possibility של למידה או עייפות. בשל זבובים עם ביצועי טיפוס ירודים ביותר, זה היה מועיל כדי להקליט את הזמן הנדרש עבור 50% מהזבובים לחצות את קו היעד לזה יכול לקחת כמות ניכרת של זמן לזה קריטריונים להתממש. במקום זאת, זבובים ניתנו משך 2 דקות לחצות את קו היעד. מספר הזבובים לחצות את הקו נרשם וזרק לפח במרווחים של 10s, וכתוצאה מכך הערך מבוטא באחוזים. תנאים אלה יוצרים הם הערכה רגישה יותר של יכולות הטיפוס של זבוב בוגר. בעוד עיצובים אחרים של assay עדיין שימושיים, פרדיגמה זו עשויה להיחשב במקרים בהם פגמים מוקדם עדינים נחקרים. בנוסף, assay זה עשוי לעזור לזהות שינויים קטנים יותר בהקשר של ניסויים בסמים. נושא חשוב הוא שהתנהגות geotaxis השלילית מבוססת על הזבובים שטפחו לתחתית של הגליל. זה Therefבצר חשוב להעריך צורות אחרות של תנועה, כגון על משטח שטוח או טיסה. היבטים אחרים כגון מוטיבציה ואינטראקציה חברתית צריכים להיחשב כלבלבל פוטנציאלי. אזהרה נוספת היא כי assay הציג מאפשר רק אחד להעריך תנועה בזבובים בוגרים. זה מגביל את היכולת להשיג קושרת נוירו להתנהגות שנצפתה שהוא מאוד חשוב בהבנת הפתוגנזה של מחלה. ואכן, רוב עבודת הדמייה שנעשה בצומת העצבית-שרירית הזחל עד כה בדרוזופילה. קבלת תנועת התנהגות בזחל עשויה להיות צעד חשוב כדי למשוך קשר ישיר בין התנהגות ושינויים פתולוגיים. זה מאוד חשוב לשלוט על הטמפרטורה ולחות שבזבובים גדלים ונבדקו. בנוסף להשפעה על התפתחות זבוב, גורמים אלה היו השפעה חשובה על יכולת הטיפוס של זבובים גדלו ומאוחסנים בתנאים שאינם תנאים אידיאליים. בעמ &#39;resence של חשמל סטטי מוגבר או לחות, זבובים לא לבצע בצורה אופטימלית. השפעה זו לא הייתה שווה לכל גנוטיפים, המוטציה הזבובים בדרך כלל להיות יותר מושפעת מגורמים כגון מאשר קבוצת ביקורת. בנוסף, צילינדרים צריכים לשטוף ולייבש היטב בין כל ניסוי.

הפרעות ניווניות הרסניות כגון מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, וparaplegia ספסטי התורשתי מוכרות יותר ויותר. למרבה הצער, רוב ההפרעות ניווניות אלה עדיין ללא טיפולים. השימוש הקליני הנרחב ב, בדיקות גנטיות משוחדת הגנום כגון רצף exome כל הוביל למספר גדל והולך של גנים שמעורבים בהפרעות קטר אנושיות. למרות התקדמות זו, ההתקדמות פתולוגיים ממוקדם לשלבים מאוחרים, נותרת חמקמקה בהפרעות אלה. תסיסנית מספקת אחד עם הכלים הגנטיים ללימוד דרישת גן באופן מרחב ובזמן בשליטה. בנוסף, תסיסנית הוכיחה שימושית בסינון תרופות לתנאי נוירולוגיות כמו פרקינסון 1, אלצהיימר 2, נכות אינטלקטואליות 3,4 ואפילפסיה 5,6 בין יתר. המטרה שלנו הייתה לפתח חסכוניוassay אמין שיאפשר ניתוח תפוקה גבוה שעדיין יהיה רגיש מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בביצועי מנוע. ישנם מספר מבחני המשמשים לכמת את ההשפעות של מוטציה גנטית ו / או תנאי סביבה על תסיסנית טיפוס התנהגות. רוב מבחני לנצל את הנטייה הטבעית של זבובים לטפס, הידוע בשם geotaxis השלילית, או assay הטיפוס. 7 Benzer הציע בשנת 1967 כי המנגנון נגד זרם המשמש למחקר של Phototaxis יכול לשמש גם כדי ללמוד gravitaxis. מאז, Ganetsky 8 ועוד רבים אחרים 9 -12 שנבנו על assay הראשוני. העיקרון הוא למקם מספר ידוע של זבובים בבקבוקון ולהקיש על הבקבוקון בחריפות נגד משטח קשה, גורם לזבובים ליפול לתחתית של הבקבוקון. כפי שהוא התנהגות מולדת, הזבובים ינסו לטפס לחלק העליון של הבקבוקון, בניגוד לכוח המשיכה. assay זה הוא כמותי וmeasuמיל כמה זבובים טיפס עבר סמן על הבקבוקון במהלך תקופת זמן מוקצב. מדידה של מהירות במקום מספר הכולל של טיפוס זבובים הפכה פרמטר אמין ולראות פגמים במקרים בהם מספר קריטריוני זבובים לא היה משמעותי 13. Assay הטיפוס הוכיח שימושי בחקר הפרעות ניווניות רבות, כולל מחלת פרקינסון 14. עם זאת, ציינו כי ליקויי קטר לא יכולים להיות לזיהוי בזמן שבו ניוון של מערכת עצבים נראים כבר במחקרים פתולוגיים 14. לפיכך, שימוש של assay המסורתי עלול להגביל את היכולת ללמוד המוקדמים של היווצרות מחלה בשלבים. המראה של פגמי קטר בשלבים מאוחר יותר של פתולוגיה עשוי לשקף מחלה ההתקדמות שלו הוא מתקדם מדי להצלה שלמה. זה מעלה בעיה פוטנציאלית עם הרגישות של assay הטיפוס המסורתי. חוסר היכולת הפוטנציאלית של tradiניתן לייחס tional טיפוס assay כדי לזהות פגמי קטר קלים עד הגובה שאליו הזבובים נדרשים לטפס. Assay 15,16 האמצעים המסורתיים מספר הזבובים לטפס בהצלחה מעל לגובה של 2 עד 5 סנטימטר ב 10 עד 20 שניות.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stocks</td><td></td><td></td><td>The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet.</td></tr><tr><td>Video camera</td><td></td><td></td><td>Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object.</td></tr><tr><td>Graduated cylinder</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height.</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td>Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point.</td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of climbing defects in a drosophila model of neurodegenerative disorders

פגמי קטר הנובעים מהפרעות ניווניות יכולים להיות סימפטום מאוחר של מחלה, לאחר שנים של ניוון תת-קליני, ואסטרטגיות טיפול טיפוליות וכך הנוכחיות אינן מרפאים. באמצעות השימוש ברצף exome כל, מספר גדל והולך של גנים זוהה לשחק תפקיד בתנועה אנושית. למרות זיהוי גנים אלה, זה לא ידוע כמה גנים אלה הם חיוניים לתפקוד נורמלי קטר. לכן, assay אמין, אשר מנצל אורגניזמים מודל על מנת להבהיר את תפקידם של גנים אלה כדי לזהות מטרות רומן של עניין טיפולי, יש צורך יותר מתמיד. יש לנו תוכנן גרסה רגיש של assay geotaxis השלילית המאפשר לגילוי פגמים קלים יותר מוקדם ויש לו היכולת להעריך ליקויים אלה לאורך זמן. Assay מבוצע בכוס סיים גליל, אשר חתום עם סרט מכשול שעווה. על ידי הגדלת מרחק הסף להיות טיפס ל -17.5 גמ &#39;ולהגדיל את משך הניסוי 2 דקות שראינו רגישות רבה יותר באיתור בעיות בתפקוד ניידות קלה. Assay הוא עלות אפקטיבי ואינו דורש הכשרה מקיפה כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור. זה עושה את זה טכניקה מעולה לסינון תרופות מועמד במוטציות תסיסנית עם מומי תנועה.

טיפוס הוא התנהגות חזקה ושחזור. ואכן, זבובים בר-סוג ישנים יום אחד להגיע לביצועי מרחק יעד הטיפוס במהירות (25 - 30 שניות). זבובים מוטנטים להציג מגוון של ביצועים בין מתון (או מאוחר) כדי להשלים חוסר יכולת לטפס ליעד. אנו להמחיש זאת כאן עם שני אללים מוטציה שונים. הראשון הוא אלל חמור של spastin הגן שנגרם על ידי מחיקה של גן spastin (ספא 5.75) 18 מלאה. בקו הזה (ספא 5.75 עם TM6b) יום אחד זבובים ישנים לא להגיע לביצועי טיפוס WT גם לאחר 2 דקות. קו מוטציה זה מציג עם מומים חמורים גם בעת שימוש בשיטת הבקבוקון (איור 1 א &#39;, ב&#39;). יתרונה של השיטה שהוצגה כאן הופך ברור יותר כאשר לומדים מוטציה באותו הגן, אבל עם מחיקה חלקית שפורסמה על ידי אותה הקבוצה (ספא 17-7 עם TM3) 18. במקרה שביצועים של עד 8 ​​ימים הוא נורמלי (איור 1 ג-ו &#39; </s<html> טרונג&gt;). בשעת 8 ימים, זבובים אלה להציג פגם בטיפוס ציין להיות קל אך משמעותי בשיטת הגליל אבל לא בשיטת הבקבוקון לאותו מספר החזרות. זה עשוי להציע שבאמצעות מרחק יעד גדול יותר מאפשר לגילוי פגמים במוטציות פחות חמורות. בחירה של בקרות גנטיים מתאימות מבטיחה כי ההשפעה היא תוצאה של ביטוי המהונדס (איור 3) או אינטראקציה גנטית. להוכחה נוספת, כולל הצלה של פנוטיפ התנהגותי עם הביטוי של חלבון פרא-סוג של הגן למד. ללימודי אינטראקציה, להשוות זבובים שהטרוזיגוטיים לשני המוטציות של עניין עם זבובים שיש מוטציה אחת של עניין בלבד. Assay גם מאפשר לעקוב אחר ההתקדמות של פגם הטיפוס לאורך זמן, היבט חשוב בדוגמנות בהפרעות של תנועה מתקדמות (איור 4). בנוסף, 2 דקות לאפשר לראות את ההתקדמות של טיפוס במוטציות חמורות יותר. התחת = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig1.jpg" /> איור 1. השוואה של מבחני טיפוס שונים. למוטציות חמורות דרגות שונות של פגם טיפוס שניתן לראות בשיטות שונות אך מוטציות מתונות יותר עשוי שלא להיות מזוהה עם כמה מבחני. כדי להמחיש זאת היינו שני קווים שפורסמו מוטציה לspastin הגן:. 5-75 spastin המכיל מחיקה מלאה של גן spastin וspastin 17-7 המכיל מחיקה חלקית של גן spastin () ראשית, טיפוס הנישום על ידי בעל זבובים לטפס לחלק העליון של בקבוקון מזון ריק. מספר הזבובים בראש לאחר 18 שניות נרשם. שימוש בפרוטוקול זה פגם משמעותי נראה בSpast 5-75 / TM6b בהשוואה לקבוצת ביקורת wild-type (N = 10, p &lt;0.001). (ב) בשלב הבא, טיפוס ביצועים נבחנים באמצעות השיטה שתוארה כאן. טיפוס הוא גם היית<html> efective בגנוטיפ זהה Spast 5-75 / TM6b. ההבדל בביצועים הוא משמעותי ביותר (N = 5, p &lt;0.001), אך הפער בביצועים הוא גדול יותר. למוטציות הראו את מחשבה השפעה פחותה (למשל, Spast 17-7 מכיל מחיקה חלקית של גן spastin), שיטת הצילינדר מוצגת כאן עשויה להיות רגישה יותר. (ג) אין פגם משמעותי הוא ציין עם 3 ימים ישנים spast 17-7 / TM3 עם שיטת הבקבוקון (N = 5). (ד) אין פגם משמעותי הוא ציין עם spast 17-7 / TM3 בן 3 ימים עם שיטת הצילינדר (N = 5). (ה) מגמה שאינה סטטיסטית יצוין עם spast 17-7 / TM3 בן 8 ימי זבובים (N = 5). (ו) אבל משמעות היא שנצפתה ל17-7 / נבדק עם שיטת הגליל הציגה לאותו המספר של משכפל (N TM3 spast בן 8 ימים = 5, p &lt;0.001).r קבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי של הניסוי להגדיר. 20 זבובים מוכנסים בגליל זכוכית ולאחר מכן כתרים עם סרט מכשול שעווה. אז הזבובים טפחו לתחתית ואת מספר זבובי חציית קו האמצע נרשם באמצעות מצלמה במשך 120 שניות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52741/52741fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig3.jpg" /> איור 3. נציגי תוצאות של ניסוי הטיפוס. אחוז של זבובים שעברו את קו הסף מיוצג כל 10 שניות על duratiעל של assay. בניסוי זה, 3 פקדים גנטיים מתאימים (Wild-סוג, ספא כטב&quot;מ -RNAi / +, Elav-GAL4 / +) בהשוואה לזבובים מהונדסים המכילים את שני מרכיבי Gal4 (ספא Elav-GAL4 / כטב&quot;מ -RNAi) כטב&quot;מ ו. כטב&quot;מ הספא-RNAi הוא מVDRC # 108,739. ייצוג זה מאפשר ההערכה של שיעור טיפוס לכל גנוטיפ. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52741/52741fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig4.jpg" /> איור 4. גרף נציג לפרופיל ההזדקנות. מאחר שרבי הפרעות קטר הן פרוגרסיבי, חשוב להציג את ההתפתחות לאורך זמן. בגרף זה, זבובי WT הם בהשוואה למוטציות הטרוזיגוטיים (ספא / WT) ומוטציות טרנס הטרוזיגוטיים (spast5-75 / spast17-7) בשעה 2 ימים (א &#39;) ו- 8 ימים (ב&#39;)(N = 10, p &lt;0.001). תוצאות מתוארות גם לאורך זמן לשניות 120. נקודת זמן (C). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52741/52741fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders at JoVE.com

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

quantitative-analysis-climbing-defects-drosophila-model

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.5K Views.  University of Alberta. We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets. 

Video: Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Genetics

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

וזמינותו אוטומטית מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים מודל דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

Behavior

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biology

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

ניתוח כמותי של פגמים טיפוס בדגם תסיסנית של הפרעות ניווניות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video