אנו מכירים סקוט ולבן בית החולים תכנית מענקי מחקר לתמיכה כספית וטקסס A &amp; M למדעי בריאות מרכז מכללה למעבדת הדמיה רפואה משולבת לשימוש במיקרוסקופ לייזר confocal. אנו מכירים מר גלן קרייר לעזרה עם עריכת כתב יד.

1. זריעה של תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תרבויות עיקריות של RBMEC של חולדות ספראג Dawley מבוגרות (או לקבל אותם באופן מסחרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח RBMECs בפיברונקטין 100 סנטימטר (50 מיקרוגרם / מיליליטר) צלחות פטרי מצופים באמצעות מדיום צמיחת תאי אנדותל במוח החולדה. לשנות את המדיום כל יומיים, עד שהוא הגיע confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהגיע confluency 80-90%, לשטוף בעדינות את התאים שבנאגרו מלוח 5 מיליליטר פוספט (PBS) על ידי מתערבל. לאחר מכן התאים מנותקים על ידי חשיפתם ל1 מיליליטר של תמיסת 0.25% חמים trypsin- חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), equilibrated עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-5 דקות, עד שהתאים מנותקים ומפוזר. הערה: לחץ על צלחת התרבות לנתק את התאים. צפה בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק של תאים מלאים מפני שטח של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה 5 מיליליטר מלא לצלחת פטרי כדי לנטרל טריפסין.פיפטה את המדיום המכיל תאים מנותקים ולאסוף אותו לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדיה המכילה תאי אנדותל ב 220 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולשמר את גלולה המכילה cells.Suspend גלולה ל3-5 בינוני צמיחת תאי אנדותל מוח החולדה מיליליטר טרי בעדינות על ידי ערבוב אותו ואת עם תאי פיפטה יהיה אז ייספר באמצעות דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לפיברונקטין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) precoated 8 מערכת קאמרי שקופיות גם סטרילי, 0.7 סנטימטר 2 / היטב עם צפיפות זריעה הנעה בין 10,000-15,000 תאים בכל טוב. לגדול התאים ב 37 מעלות צלזיוס עד המפגש מושגת הערה: לביצוע כתמים מערביים או ניסויים אחרים, ניתן לגדל תאים בצלחות תרבית תאי 10 סנטימטרים או מנות מיוחדות כנדרש בניסוי. </li></ol> 2. חמצן וגלוקוז קיפוח Reoxygenation במבחנהדגם הערה: הפרוטוקול הבא הותאם מאל Zulueta et. 1997; ג&#39;ו H et al. 2,012 8,9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת תרבות תא היפוקסיה כדי לחקור את ההשפעות של של OGD-R על RBMECs ב( ראה איור 1). התקנה ולכייל את מערכת תרבית תאי היפוקסיה לפני תחילת הניסוי, על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות קאמריות ומחוברות (שלב 1.8) מחממת 37 ° C. החלף את המדיום השלם בשקופית הקאמרית עם deoxygenated, אין גלוקוז, בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) והניח בתא היפוקסיה עם 95%, N 2, 5% CO 2 עבור 2 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לייצג מצב OGD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את התאים בחזרה לחממה עם 95% O 2, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס ומסופק עם מדיום תא האנדותל טרי מוח חולדה מלא ודגירה עבור שעה 1 אחרת על 37 מעלות צלזיוס. הערה: שלב זה מייצג מצב reoxygenation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשקופיות קאמריות ללוקליזציה immunofluorescence ותיוג phalloidin rhodamine (ראה סעיף 3). </li></ol> 3. Immunofluorescence לוקליזציה של תיוג -actin ZO-1 ו- F שימוש Rhodamine Phalloidin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את השקופיות קאמריות המכילות monolayers RBMEC לתקשורת של Opti-ממ / סרום מופחת / 100 μl גם עבור שעה 1. שטוף את השקופיות קאמריות 3 פעמים בשל פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH 7.0-7.2) 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים באמצעות של paraformaldehyde 4% 100 μl בPBS (pH 7.0-7.2) במשך 15 דקות ולשטוף את השקופיות קאמריות לפי 3 יותר בPBS (pH 7.0-7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים באמצעות של 0.5% Triton X-100 ב PBS 100 μl, (pH 7.0-7.2) לעוד 15 דקות. לחסום עם של 2% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS 100 μl לשעה. לאחר שלב זה או תאי כתם / תווית או לתקטין ZO-1 או זיונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לSTA immunofluorescenceining דגירה התאים עם נוגדן נגד ארנב עיקרי נגד ההסתדרות ציונית-1 ב 1: 150, שהוכן ב 2% BSA-PBS לO / N ב 4 מעלות צלזיוס. שוטפים את התאים 3 פעמים PBS, (pH 7.0-7.2). דגירה עם של isothiocyanate והעמסת (FITC) 100 μl -tagged נוגדנים משני נגד ארנב עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיוג Rhodamine Phalloidin, הבאים חסימה, לחשוף את התאים לשל phalloidin rhodamine 100 μl ב01:50 דילול, שהוכן ב 2% BSA-PBS, במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים ממכתים immunofluorescence ותיוג rhodamine phalloidin ב PBS, (pH 7.0-7.2). הר התאים באמצעות תקשורת הרכבה המכילה מגיב אנטי לדעוך עם DAPI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים באמצעות עדשת טבילה במי 60 X ותאים נסרקים במטוס אופטי בודד תחת מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia/reperfusion+injuries+in+rats.">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li><li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions.">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li><li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier,+reperfusion+injury,+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke.">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 (13), S52-S57 (2012).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia.">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li><li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties.">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li><li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation.">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells.">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li><li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation.">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li><li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor,+generation+of+reactive+oxygen+species,+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon.">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li><li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics.">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li><li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation.">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li><li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability.">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

OGD-R כמודל במבחנה לפגיעה איסכמיה reperfusion כבר מבוסס היטב ללימוד נוירונים 10,11. ישנם גם מחקרים המראים את ההשפעה של OGD על תאי האנדותל מוח ושינויים בחדירות וTJ יושרה 9. עם זאת, המחקר שלנו מראה את ההשפעה של OGD כמו גם reoxygenation, אשר היא ייצוג קרוב של פגיעת reperfusion איסכמי בתנאי in vivo המתרחשים שבץ איסכמי הבא. תנאי חוסר חמצן-איסכמי ידועים לגרום לדלקת במערכת העצבים המרכזית, שהובילה לשיבוש BBB על ידי הגדלת חדירות paracellular ובצקת vasogenic 4. פגיעת reperfusion היא תהליך מאוד מורכב ודינמי, שבו יש ייצור מיני חמצן מגיבים מוגזם, דלדול ATP, לעלות באשלגן תאי, שחרור של שליחים עצביים מעוררים, אנדותל ונפיחות עצביות, הפעלת תאים חיסונית. זה, בתורו גauses הפעלה של מסלולים דלקתיים שונים, שמוביל לייצור ציטוקינים, אינדוקציה של nucleases ופרוטאזות, שמוביל לבצקת, אשר כולם מוצגים להפעיל caspases השונים, שהוביל לשיבוש שלמות BBB 5,12. תאי האנדותל נוטים במיוחד לפגיעת איסכמית, בשל נוכחותם של מספר הגדול של מיטוכונדריה. תאי האנדותל השכנים צמודים זה לזה על ידי צמתים הדוקים מתוחזק על ידי חלבוני צומת הדוקים. ZO-1 מוצג לשחק תפקיד חשוב בשמירה על שלמות TJ על ידי האינטראקציה שלה עם חלבוני צומת הדוקה האחרים ו &#160; ההרכבה cytoskeletal אקטין. כמו כן, רגולציה מדויקת של cytoskeleton אקטין היא חיונית לתהליכים רבים התפתחותיים ופיסיולוגיים כוללים הידבקויות תא-תא. בתאי האנדותל, היווצרות מתח סיב אקטין נמצאת להיות קשורים לבעיות בתפקוד המחסום וhyperpermeability 13,14. phalloi rhodamineדין טכניקת תיוג השתמשה במחקר הנוכחי להתבונן היווצרות מתח סיב F- אקטין הוא מחקר נקודת סיום. עם זאת, הדמיה דינמית וחייה של היווצרות מתח הסיבים יכולה גם להתבצע כפי שמוצגת על ידי דוגט ו -15 ברסלין. המחקר הנוכחי מדגיש את התרומה majorly של ההסתדרות ציונית-1 לכיוון שלמות הצומת ההדוקה BBB. עם זאת, מולקולות אחרות הדוקות צומת כמו claudin-5, occludin, מולקולות הידבקות junctional (JAM) וכו &#39;יכולות לשמש גם כסמנים ללמוד על שלמות הצומת ההדוקה BBB הבא OGD-R. במחקר זה, אנחנו עובדים לוקליזציה immunofluorescence ותיוג F- אקטין כטכניקה איכותית כדי לקבוע את יושרת הצומת ההדוקה. עם זאת, אנחנו יכולים גם ללמוד את המאפיינים חשובים האחרים של BBB כמו מדידת כמותית של חדירות באמצעות סמני ניאון והתנגדות Transendothelial חשמלי (Teer). טכניקת OGD-R שהוצגה במחקר זה באמצעותמערכת Biospherix יכולה לשמש רק ללימודי היפוקסיה / אנוקסיה בריכוז קבוע של חמצן; עם זאת, אנחנו לא יכולים להעסיק את המערכת ללימוד ההשפעה של ריכוזים שונים של חמצן בתאי האנדותל. לחקר ההשפעות של ריכוזים שונים של חמצן בתאי האנדותל אנחנו צריכים להעסיק דגמים זמינים אחרים המתאימים למטרה זו. טכניקה זו יכולה לשמש ללימוד היחסים מכניסטית בין אירועים תאיים ומולקולריים השונים המסדירים hyperpermeability BBB ויושרה TJ. הבנתם תספק תובנה לפיתוח אסטרטגיות מולקולריות שונות כדי להחליש הפרעה BBB וחדירות כלי דם.

איסכמיה reperfusion פציעה (IR) נמצאת להיות הסיבה השכיחה לסיבוכים שונים מתישים ומקרי מוות הקשורים לאירוע מוחי, אוטם שריר לב, טראומה, מחלת כלי דם היקפית ופגיעה מוחית טראומטית 1,2. פציעת IR בכלי מוח היא פגיעה משנית מוקדמת וגורמת לדלקת ובצקת 3. אחד הסיבוכים החמורים המתרחשים כתוצאה מחמצון ולחץ מטבולים הבאים דלקת הוא אובדן שיווי משקל homeostatic המוביל להיווצרות של רדיקלים חופשיים, שינויים במחסום דם-המוח (BBB) ​​צמתים הדוקים (TJS) וחדירות כלי דם 4,5. נכון לעכשיו, במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR על BBB כוללים עורקים התיכון ספיגה מוחין (MCAO), microembolism, ובעלי חיים מהונדסים או נוק אאוט. עם זאת, לכל אחד יש חסרונות ומגבלות שלה כפי שפורט על ידי Hossmann 6. מודל MCAO משמש ללמוד effecTS של מתח חיזור, שינויים בתקשורת junctional של BBB ויחסי הגומלין בין המוח ותאי חיסון. עם זאת, הם מציגים אתגרים טכניים שונים כגון צורך בנהלים מדויקים מייקר והקשיים בהם. Microembolism שובר באופן מיידי את BBB תוך שימוש בבעלי החיים מהונדסים או נוק אאוט ללמוד איסכמיה מוחית עשוי להיות אתגרים כמו השפעות גן תלוי מולקולריות על היווצרות אוטם, שינויים באנטומיה של כלי דם ומשקל גוף שונה 6. מכאן, במבחנה מודלים של איסכמיה שמצאו עניין גובר בתקופה האחרונה בעיקר בבגלל תחולתם בביצוע מחקרים מכניסטית לסמים. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה לא יכולות לייצג באופן מלא מחקר in vivo ויש לפרש בזהירות 6. פעולה נוגדת של ריכוזי חמצן נמוכים בmonolayers תא אנדותל וחדירות כלי דם הייתהלמד על ידי 7 Ogawa. תאי כלי דם במוח חולדה אנדותל (RBMECs) שמשו לפיתוח במבחנה BBB. טכניקת המחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) הוצגה בפרוטוקול זה הותאמה ממחקרים על ידי אל Zulueta et וג&#39;ו ואח &#39;8,9. אנו נחשפים לתאי אנדותל מוח לOGD-R על ידי הצבת אותם בתא היפוקסיה / אנוקסיה המכיל 0% O 2, 5% CO 2 ו -95% N 2. תאים מאוחר יותר נבדקו לשינויים במבנה סיבי יושרה ולחץ TJ באמצעות לוקליזציה immunofluorescence ותיוג phalloidin rhodamine בהתאמה. מכתים immunofluorescence לoccludens-1 zonula (ZO-1) מבוצע כדי לקבוע שלמות TJ, כZO-1 הוא קרום פיגומים חשוב מחויב חלבון TJ. תיוג Rhodamine Phalloidin קובע אקטין פילמנטיות (-actin ו) בשלד תא התא והוא אינדיקציה ברורה של היווצרות מתח סיב אקטין בתאי אנדותל. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; מטרתה של שיטה זו היא לספק תובנה פיתוח OGD-R כבמבחנת מודל IR ללימוד שלמות BBB תא האנדותל TJ והיווצרות מתח סיב F- אקטין. התוצאות תספק מידע על גורלו של חלבון TJ, ZO-1 והיווצרות מתח סיב הבא OGD-R. הבנת יחסים אלה מספקת הזדמנות כדי לקבוע את המנגנונים מולקולריים שבבסיס שמופעלים הבאים OGD-R ולפתח אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות כדי לשפר את ההפרעה BBB לאחר טיפול OGD-R.

<table><tbody><tr><td>Proox model 110</td><td>Biospherix</td><td>Model 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&amp;nbsp;well sterile, glass&amp;nbsp;slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Any other PBS available can be used</td></tr></tbody></table>

oxygen-glucose deprivation and reoxygenation as an in vitro ischemia-reperfusion injury model for studying blood-brain barrier dysfunction

איסכמיה reperfusion פציעה (IR) ידועה לתרום באופן משמעותי לתחלואה ותמותה הקשורים בשבץ איסכמי. תאונות כלי דם במוח איסכמי מהוות 80% מכל מקרי השבץ. סיבה שכיחה לפגיעה IR היא הזרימה המהירה של נוזלים הבאים חסימה אקוטית / כרונית של דם, חומרים מזינים, חמצן לרקמה מפעילה ההיווצרות של רדיקלים חופשיים. שבץ איסכמי ואחריו מחסום דם-מוח בתפקוד (BBB) ​​ובצקת מוחית vasogenic. מבחינה מבנית, צמתים הדוקים (TJS) בין תאי האנדותל ממלאים תפקיד חשוב בשמירה על שלמות מחסום דם-המוח (BBB). פציעת IR היא פגיעה משנית מוקדמת שהובילה לתגובה הלא ספציפית, דלקתית. חמצוני ולחץ מטבולים הבאים דלקת גורם לניזק מוחי המשני כוללים חדירות BBB ושיבוש צומת הדוקה יושר (TJ). הפרוטוקול שלנו מציג במבחנה &lt;/ Em&gt; דוגמא למחסור בחמצן גלוקוז וreoxygenation (OGD-R) בתא האנדותל מוח החולדה שלמות TJ והיווצרות מתח סיב. נכון לעכשיו, כמה ניסויים במודלי vivo משמשים כדי לחקור את ההשפעות של פגיעת IR; עם זאת יש להם כמה מגבלות, כגון אתגרים הטכניים בביצוע ניתוחים, השפעות מולקולריות תלויות גן וקושי בלימוד יחסים מכניסטית. עם זאת, במבחנה מודלים עשויים לסייע בהתגברות על מגבלות רבות של אלה. הפרוטוקול שהוצג יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים השונים ומערכות יחסים מכניסטית לספק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, התוצאות של מחקרים במבחנה עשויות להיות שונות מרגילות במחקרי vivo ויש לפרש בזהירות.

תאים בתרבית בשקופיות Precoated פיברונקטין Nunc השני קאמריות היו נתונים לOGD-R על ידי הנחת בתא 110 מודל Biospherix ProOx. לאחר חשיפת תאים לOGD-R, הם עובדו לצביעת junctional ZO-1 באמצעות טכניקת immunofluorescence כפי שמוצג באיור 2 והרכבת cytoskeletal מצביע היווצרות מתח סיב F- אקטין באמצעות תווית כתם phalloidin rhodamine כפי שמוצגים באיור 3. תאי בקרה שהיו לא נתון לOGD-R הראה שלמות junctional מתמשכת תוך תאי האנדותל נתון OGD-R הראו צמתים רציפים, המצביעים על הפסד של איור שלמות TJ 2. תאי בקרה שלא נחשפו לטיפול OGD-R הראו סיבי מתח מינימאליים F -actin לא או היווצרות תוך תאי האנדותל נתון OGD-R הפגינו היווצרות F מתח -actin סיבים מוגברת המציינת את השינויים באיור ההרכבה cytoskeletal אקטין 3; נציג<html> דפס באישור הפניה # 13 <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig1.jpg" /> איור 1. תצורה אופיינית של דגם ProOx מערכת היפוקסיה 110. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52536/52536fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig2.jpg" /> איור 2. Immunofluorescence לוקליזציה של חלבון צומת הדוק (TJP) ZO-1 הדגמת שיבוש של צומת הדוקים הבאים OGD-R בRBMECs, כפי שמוצג על ידי לבנים חצים. סרגל = 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52536/52536fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> &quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52699/52699fig3.jpg" /> איור 3. Rhodamine Phalloidin תיוג לגיבוש ו סיבי מתח -actin הדגמת שינויים בCytoskeletal העצרת בעקבות OGD-R בRBMECs, כפי שמוצגים על ידי לבנים חצים. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52536/52536fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction at JoVE.com

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

17.9K Views.  Texas A&M University Health Science Center College of Medicine. Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells. 

Video: Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is characterized by an interruption in blood supply to the brain leading to cell death and cognitive dysfunction. During and after ischemic stroke, blood-brain barrier (BBB) dysfunction facilitates injury progression and contributes to poor patient recovery. Current BBB models primarily include endothelial monocultures and double co-cultures with either astrocytes or pericytes.
Such models lack the ability to fully imitate a dynamic brain microenvironment, which is essential for cell-to-cell communication. Additionally, commonly used BBB models often contain immortalized human endothelial cells or animal-derived (rodent, porcine, or bovine) cell cultures that pose translational limitations. This paper describes a novel well-insert-based BBB model containing only primary human cells (brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and brain vascular pericytes) enabling the investigation of ischemic brain injury in vitro. 
The effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on barrier integrity were assessed by passive permeability, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements,and direct visualization of hypoxic cells. The presented protocol offers a distinct advantage inmimicking the intercellular environment of the BBB in vivo, serving as a more realistic in vitro BBB model for developing new therapeutic strategies in the setting of ischemic brain injury.

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Here, we describe the method for establishing a triple cell culture model of the blood-brain barrier based on primary human brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. This multicellular model is suitable for studies of neurovascular unit dysfunction during ischemic stroke in vitro or for the screening of drug candidates.

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Biochemistry

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunology and Infection

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Neuroscience

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

שתיים, כלי סגר דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

מודל מחסום דם-מוח תלת-ממדי המופק מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

מחבר זרקור: גישה מותאמת אישית לחקר מחלת אלצהיימר באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית

הגדרה למעלה

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

שתיים, כלי סגר דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות