Name: an in vitro dormancy model of estrogen-sensitive breast cancer in the bone marrow: a tool for molecular mechanism studies and hypothesis generation
Uploaded: 2015-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation at JoVE.co

יש המחברים אין לחשוף.

1. Assay clonogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות תא בודדות של שורות תאי סרטן השד תלוי באסטרוגן תאי MCF-7 וT47D באמצעות הצעדים המפורטים להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום התרבות (DMEM / 10% חום בסרום / גלוטמין מומת עגל עוברי ועט / סטרפטוקוקוס) מצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים שאינה מחוברים יותר מ- 50% עם MCF-7 או תאי T-47D. לשטוף עם PBS. דגירה עם טריפסין 0.25% / 2.21 mM EDTA מומס בגלוקוז הגבוהה DMEM על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תאים במרווחי 1 דקות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב כדי להבטיח הפצת תא בודדת. Resuspend תאים עם טפטפת 2 מיליליטר ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבש קשר תאי תאים כדי להשיג מעמד תא כמעט בלתי משתנה, אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לדגור תאים בטריפסין על 37 מעלות צלזיוס במשך עד 4 דק &#39;אם אתה רואה גושים של תאים רק לאחר 2 דקות של דגירה. אין להשתמש בתאים אלה ללימודי clonogenic אם הם יישארו חסיד לדוארבגלל שגיאה יושקו אח אחר לאחר 4 דקות של trypsinization בתשואת מספר המושבה. הערה: אם תאים בכבדות, מספר מושבות הוקמו ישקף את המוצר של פחות תאים מהמספר מודגרות. אם תאי trypsinized מוגזמים, פוטנציאל clonogenic עשוי להצטמצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודדת של 1,500 תאים / בינוני תרבות מיליליטר במשך 24 צלחות גם, או, פחות (+ 500 מיליליטר / תאים, בהתאם לסוג התא או מספר מעבר), על ידי דילולים סדרתי בצינור ראשי אחד המכילים את כל הנפח הדרוש ל כל המשתנים בניסוי. הערה: המטרה היא צפיפות תא סופית של 800 תאים / 2 סנטימטר (טווח של כ -500 עד 1,100 תאים / 2 סנטימטר). המטרה היא להניב כ 100 + 50 מושבות, המאפשרת ספירה קלה יחסית, מונעת צפיפות ומאפשרת מושבות מספיק כדי לגרום להבדלים סטטיסטיים משמעותיים כאשר מושבות עלו או ירד בperturba הניסיונימשא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דגירה בצפיפות clonogenic שימוש צעדים המפורטים להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בבארות ארבע פעמים ב -24 צלחות מצופים פיברונקטין גם בצפיפות clonogenic של 1500 תאים / גם מצינור השעיה תא בודד אדון של 1,500 תאים / מיליליטר. Triturate הבינוני המכילים תאים עם טפטפת 5 מיליליטר על ידי ציור עד 3 מיליליטר וניפוק בינוני 1 מיליליטר בכל אחד מ2 בארות. הערה: צלחות מצופה פיברונקטין יש לרכוש מראש מצופים מספק מסחרי. צלחות ציפוי חיצוניים של איכות מבוקרת, תוצאות תהליך אוטומטיות במשטח אחיד שלא התאימו לassay זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טפטפת 5 מיליליטר, להכין 3 מיליליטר של השעיה תא ולמלא 2 בארות עם 1 מיליליטר כל אחד. מלא רק 2 בארות בכל זמן מפיפטה אחד. להחזיר את הנפח שנותר בפיפטה ההשעיה התא בצינור הראשי, תאים גלולים שוב על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהכין עוד 3 מיליליטר כדי למלא עוד 2 welLS עם 1 מיליליטר כל אחד. הערה: ערבוב רציף של הצינור הראשי הוא הכרחית, כי תאים יהיו ברציפות משקעים. הכנת נפח מספיק כדי למלא רק 2 בארות יש צורך להוסיף מספרים סלולריים דומים זה לזה היטב, כי תאים משקעים, כמו גם בפיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד במהירות כדי להפיץ כמויות הגדולות של תאים כי תאים המאפשרים לשבת בהשעיה בטמפרטורת חדר וריכוז CO 2 יהיה לווסת (התצפיות לא פורסמו) פוטנציאל clonogenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את הפריסה המרחבית של תאים במהלך הפעולה של pipetting אותם לבארות למבחני מושבה. לעשות זאת על ידי pipetting ההשעיה המכילה ריכוז התא הסופי לאמצע גם לאט. אל תחשוף את הצלחת כדי לקדם את התנועה לפני תאים ליישב לתחתית. לא לערבל את הצלחת כי ערבוב החוזר ביעילות צנטריפוגה התאים להיקף של צפיפויות גבוהות תא גם יצירת ומושבות ומחוברות לאינספור בשעה 6 ימים. הערה: אין לערבב אלא אם יש צורך, מאחר שזו פחות רצויה מאשר ללא ערבוב בכל לאחר החדרת הנפח עם התאים בתרחיף. אם יש צורך לערבב תאים, עושה זאת על ידי העברת הצלחת קדימה ואחורה בכיוונים ניצבת בזמן שהוא נח על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ללא שינוי תקשורת במשך 6 ימים. המספר הקטן של תאים ובלאחר 6 ימים לא ישפיע באופן משמעותי את ההרכב התזונתי או ציטוקינים ולא את ה- pH של המדיום המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את הקורס של assay הזמן כדלקמן: דגירה תאים בsubstrata פיברונקטין מצופה ביום 1. החלפה הקיימת בינוני עם 1 מיליליטר בינוני טרי או בינוני טרי המכיל FGF-2 10 / מיליליטר ng ביום 0. תאי כתם ביום 6 להלן ב1.4). לנהל כל הפרעות ניסיוניות ביום 3, כלהלן 1.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרעות ניסויי הגדרה מולקולרית איתות או הדבקה מולקולות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להוסיף 10056; L של תמיסה המכילה 10x של הריכוז המיועד הסופי של הסוכן המדאיג למדיום מיליליטר 1 בבארות. אל תערבב. המשך דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל3 ימים נוספים. הערה: מביך סוכנים יכול לכלול מגוון של מעכבים וסוכני חסימה של מולקולות דבקות, קולטנים או חלבוני משטח אחרים, מעכבים של מסלולי איתות תאיים, מולקולות, גורמים, קו-פקטורים או חלבונים מבניים, שעשויה לשחק תפקיד בתמיכה במצב הרדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות כתם על יום 6, כדלקמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם לאחר 6 ימים בתרבות עם 0.1% סגולים קריסטל טרי ב 2% אתנול / 10 borate נתרן מ&quot;מ (pH 9.0) פתרון. תקשורת לשאוב ולהוסיף פתרון סגול גביש מיליליטר לכל אחד גם עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות ידי שיקוע שלהם עם הפתחים גם כלפי מטה בזווית חדה לדלי קרח עולה על גדותיו עם ברז פועל ברציפותמים בכיור. הטה את הצלחת לזווית אופקית פעם מתחת למים, גם פתיחה מטה, ולאחר מכן להטות חזרה לזווית חדה בעת הסרת בתנועה זורמת עדינה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הטבילה 2 או 3 פעמים עד שהמים בחלק התחתון של הבארות הוא כבר לא כחולים. שוטף נמרץ עשוי להסיר תאים או מושבות כי הם פחות חסיד בשל התערבות ניסיונית, והוסיף באופן משמעותי לשגיאה בספירה ונתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות יבשים לילה על ידי הצבת אותם במהופך על מגבות על גבי הספסל הסמוך לכיסויי שהכותרת המתאימים שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר המושבות גדלו ורדומות בכל הטוב אחרי 6 ימים של דגירה, צביעה וייבוש. ספירת מושבות בצורה אופטימלית ב40X ההגדלה במיקרוסקופ לעומת שלב הפוך. ספירת מושבות של&gt; 30 תאים כגדלו ומושבות של 12 או פחות תאים, עם המראה המורפולוגי של גודל גדול מאוד בהשוואה לexpa גדל תאים, גדולציטופלסמה nded עם ציטופלסמה הגדולה לגרעין יחסים, שמוצגים באיור 1 7,15. הערה: אשכולות של 13-29 תאים בדרך כלל לא נספרו כמו שהם לא מאוד תכופים במבחני תרדמת פשוטים. הם ניתן לספור אם הפרעות להעביר את פוטנציאל הצמיחה של שני תאי גידול או רדומים. אז תוצאות אלו צריכה להיות מתואמות עם משמעות ביולוגית. </li></ol></li></ol> 2. clonogenic דגירה לImmunofluorescence לימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם מספרים סלולריים לכ 7,500-8,000 תאים / גם ב 6 צלחות גם, למתאימים לתא מספרים / שטח דומה לניסויים גם 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עגול,, להחליק לכסות מצופה פיברונקטין סטרילי לכל בסיס גם של 6 צלחות גם למחקרי הדמיה לפני בנוסף תא. תאי Pipet ב 3 מיליליטר כרכים לתוך זה גם 2 בארות בכל פעם בריכוזים התוו, כפי שתואר עבור ניסויי clonogenic לעיל ב1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאיםבמשך 6 ימים, כאמור לעיל וב1.2.4 1.2.5. להוסיף גורמים מדאיגים ביום 3 ב10x ריכוזים בכרכי μl 300, כפי שמתואר בנהלי assay המושבה ב1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם על יום 6 עם נוגדנים לתא מולקולות הדבקה כגון α4 integrins, α5, α6, β1, β3, למשל, מולקולות מורכבות הידבקות מוקד FAK, paxillin וvinculin, למשל, חלבונים מעורבים בתנועתיות כגון α-טובולין, לדוגמא, חברי מסלול איתות כגון phospho-AKT, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, למשל, או כל חלבון אחר שהוא היעד של חקירה לתפקידה בתרדמת, תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית עבור ישיר או עקיף מכתים immunofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות עם יום מלקחיים 6. תיקון באצטון / מתנול 1: 1 ב -20 ° C במשך 20 דקות ואוויר יבש. מקבע חלופי, כגון paraformaldehyde, ניתן להשתמש, במידת צורך. תאי Permeabilize עם 0.1% X-100, נתרן ציטרט 0.1% טריטון לו 2 דקותאו זיהוי של אנטיגנים תאיים. לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים immunofluorecence עקיף, שקופיות בלוק עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר עם BSA 5% או 10% בסרום preimmune מהמינים שבנוגדנים משני נוצרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים ראשוניים לתא מולקולות הדבקה, מולקולות מורכבות מוקדי, איתות חברי מסלול או כל חלבון אחר שהוא היעד של חקירה לתפקידה בתרדמת בדילול לדילולים ספציפיים מומלצים על ידי היצרן בPBS 0.1% Triton X -100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם PBS. דגירה התלושים לכסות עם נוגדני fluorophor מצומדות- בטמפרטורת חדר למשך שעה 2. כדוגמא, אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר IgG נוגדנים חמורים יכולים לשמש כדי לזהות נוגדנים חד שבטיים עיקריים עכברי. הר coverslips צד תא על שקופיות זכוכית באמצעות סוכן antifade עם DAPI. חותם את היקפה עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לimmunofluorescence הישיר, לבצע את BSAחסימה כאמור ב2.4.2), דגירה עם נוגדן ראשוני fluorophor מצומדות- הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים עם PBS. דגירה השקופיות עם סוכן antifade וDAPI וחותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגשי שקופיות מכסים ברדיד האלומיניום ולאחסן ב 4 ° C להדמיה וצילום בכל עת עד כמה שבועות לאחר מכן. תאי צפייה וצילום באמצעות כל מערכות הדמיה מיקרוסקופיות הקרינה מצוידת במצלמה ב1,000x הגדלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים אקטין סיבי, שקופיות בלוק ב 1% אלבומין בסרום שור (BSA) למשך 30 דקות ודגירה בBODIPY FL-Phallacidin (ירוק) או phalloidin Rhodamine (אדום) בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. הוסף סוכן antifade ולאטום כאמור לעיל. </li></ol></li></ol> 3. clonogenic דגירה למחקרים מולקולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמים מערביים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ER + תאי סרטן שד MCF-7 או T47D בצפיפויות clonogenic של / 100 מ&quot;מ צלחת 20,000 תאים / 60 צלחת מ&quot;מ ו50,000 תאים בfibronecצלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 מצופי פח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בצפיפויות גבוהות מעט יותר של 75,000 תאים / 100 מ&quot;מ צלחת למחקרים מולקולריים הדורשים כמויות מ&quot;ג לחלבון מlysates. השתמש עד עשר צלחות לכל נקודה ניסיונית כדי לאסוף מספיק חלבון ללימודים מולקולריים באמצעות כתמים מערביים או לבידוד RNA לכתמי צפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת ג&#39;ל על בסיס מספר התא היא תוספת הכרחית להשוואת ביטוי חלבון בתאי גידול ורדום בגדלים שונים בהרבה. איסוף תאים על ידי trypsinizing ולספור aliquot בhemocytometer ב0.2% trypan הכחול להכנת lysates לכתמים מערביים במקום מגרד את התאים עם להב קצה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 10,000 XG למשך 2 דקות, להסיר את התקשורת על ידי שאיפה, להוסיף 200 חיץ תמוגה μl, sonicate התאים במאגר תמוגה ולקבוע את ריכוז החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות חלבון לכל תא על ידי חלוקת תשואת החלבון במספר התאיםשנוצר סכום זה. טען את lysate לבאר כל ג&#39;ל polyacrylamide הנפרד שמייצג שני) כמויות שווה של חלבון וב) כמויות חלבון המייצגות מספרים סלולריים שווי ערך. לפחות 25 מיקרוגרם חלבון צריך להיות טעון לתוך כל אחד. הערה: זה יאפשר השוואות בין תאי גידול והרדומים, שהם שונים באופן משמעותי בגודל ותכולת חלבון (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים מצלחות 100 מ&quot;מ על ידי trypsinization, כמו ב3.1 ולנתח על ידי תא הקרינה סטנדרטי הופעל מיון פרוטוקולים (FACS) באמצעות מכתים immunofluorescence ראשוני או המשני לשני אנטיגנים תאיים או תאיים, כפי שתואר ב2.4. הערה: ניתוק תאים מצלחות תרבית רקמה על ידי trypsinization אינו משפיע על הריכוז של חלבונים בממברנה, כפי שנקבע על ידי תיוג נוגדן. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratin-positive+cells+in+the+bone+marrow+and+survival+of+patients+with+stage+I,+II,+or+III+breast+cancer.">Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer.</a> N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).</li><li>Benoy, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+microvessel+area+of+the+primary+tumour,+and+not+lymph+node+status,+predicts+the+presence+of+bone+marrow+micrometastases+detected+by+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+in+patients+with+clinically+non-metastatic+breast+cancer.">Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).</li><li>Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inverse+relationship+between+microvessel+counts+and+tumor+volume+in+breast+cancer.">The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer.</a> Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).</li><li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+in+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).</li><li>Phadke, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+metastatic+breast+cancer+cell+trafficking+in+bone.">Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+an+effect+of+adjuvant+chemotherapy+on+the+elimination+of+single+dormant+tumor+cells+in+bone+marrow+of+high+risk+breast+cancer+patients.">Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients.</a> J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).</li><li>Korah, R., Boots, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5&#946;1+promotes+survival+of+growth-arrested+breast+cancer+cells:+an+in+vitro+paradigm+for+breast+cancer+dormancy+in+bone+marrow.">Integrin &#945;5&#946;1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow.</a> Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).</li><li>Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavopiridol+blocks+integrin-mediated+survival+in+dormant+breast+cancer+cells.">Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells.</a> Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).</li><li>Braun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Kim, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+signatures+and+metastasis+in+estrogen+receptor+positive+and+negative+breast+cancer.">Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer.</a> PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).</li><li>Hanin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+invisible:+how+mathematical+models+uncover+tumor+dormancy,+reconstruct+the+natural+history+of+cancer,+and+assess+the+effects+of+treatment.">Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 261-282 (2013).</li><li>Wilkie, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+mathematical+models+of+cancer-immune+interactions+in+the+context+of+tumor+dormancy.">A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 201-234 (2013).</li><li>Barkan, D., Green, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+to+study+tumor+dormancy+and+the+switch+to+metastatic+growth.">An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth.</a> J Vis Exp. (54), e2914 (2011).</li><li>Barrios, J., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+FGF-2+and+intergrin+&#945;5&#946;1+signaling+mediate+GRAF-induced+RhoA+inactivation+in+a+model+of+breast+cancer+dormancy.">Dual FGF-2 and intergrin &#945;5&#946;1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy.</a> Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).</li><li>Ganapathy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+breast+cancer+metastasis+is+dependent+on+estrogen+signaling.">Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling.</a> Clin &amp; Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+niche+regulates+breast+tumour+dormancy.">The perivascular niche regulates breast tumour dormancy.</a> Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).</li><li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inhibition+of+the+lysophosphatidic+acid+receptor+1+on+metastasis+and+metastatic+dormancy+in+breast+cancer.">Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer.</a> J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).</li><li>Almog, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+regulatory+pathways+involved+in+persistence+of+dormant+micro-tumors.">Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 734, 3-17 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+FGF+causes+growth+arrest+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells+while+inducing+both+mitogenic+and+inhibitory+G1+events.">Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events.</a> Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+the+growth+inhibition+of+human+breast+cancer+cells+by+basic+fibroblast+growth+factor.">Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor.</a> Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).</li><li>Fenig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+growth+inhibition+and+Mitogen-activated+Protein+Kinase+activation+in+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).</li><li>Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+temporal+and+spatial+gene+expression+of+fibroblast+growth+factor+family+members+during+mouse+mammary+gland+development.">Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development.</a> Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).</li><li>Plath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+members+of+the+fibroblast+growth+factor+family+in+the+bovine+mammary+gland.">Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland.</a> J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).</li><li>Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+evidence+of+basic+fibroblast+growth+factor+action+in+mouse+mammary+gland+development.">In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development.</a> FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).</li><li>Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localization+of+growth+factors+during+mammary+gland+development.">Expression and localization of growth factors during mammary gland development.</a> Adv in Exp Med &amp; Biol. 480, 19-27 (2000).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+FGF-2+promotes+differentiation+in+T47-D+breast+cancer+cells.">Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells.</a> Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).</li><li>Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinate+loss+of+FGF-2+and+laminin+5+expression+during+neoplastic+progression+of+mammary+duct+epithelium.">Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium.</a> Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).</li><li>Wieder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+basic+fibroblast+growth+factor+in+MCF-7+human+breast+cancer+cells:+lack+of+correlation+between+inhibition+of+cell+growth+and+MAP+kinase+activation.">Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation.</a> J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).</li><li>Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+release+of+basic+fibroblast+growth+factor+from+human+bone+marrow+cultures+as+a+biologically+active+complex+with+a+phosphatidylinositol-anchored+heparan+sulfate+proteoglycan.">Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan.</a> J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).</li><li>Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+stimulates+myelopoiesis+in+long-term+human+bone+marrow+cultures.">Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures.</a> Blood. 77 (5), 954-960 (1991).</li><li>Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblast+heparan+sulfate+is+required+for+cytokine-mediated+ex+vivo+maintenance+of+human+long-term+culture-initiating+cells.">Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells.</a> Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).</li><li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farnesyl+transferase+inhibitor+treatment+of+breast+cancer+cells+leads+to+altered+RhoA+and+RhoC+GTPase+activity+and+induces+a+dormant+phenotype.">Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype.</a> Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).</li><li>Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+confers+a+more+differentiated+phenotype+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells.">Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes &amp; Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dormant+estrogen-dependent+breast+cancer+micrometastases+by+bone+marrow+stromal+injury+in+an+in+vitro+model+of+dormancy.">Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy.</a> Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , (2014).</li></ol>

נתמך על ידי משרד הגנה מענקי DAMD17-01-C-0343 וDAMD17-03-1-0524, נציבות מדינת ניו ג&#39;רזי בחקר הסרטן 02-1140-CCR-E0 ורות Estrin גולדברג הזיכרון לחקר הסרטן (RW)

המודל שלנו מורכב ממספר אלמנטים המרכזיים של תרדמת במח העצם. זה מורכב של אסטרוגן תאים רגישים, שהם הסוג צפוי להישאר רדום במוח לפרקי זמן ממושך 10, זה מורכב של פיברונקטין, אלמנט מבני עיקרי של מוח, FGF-2, גורם גדילה מסונתז בשפע על ידי סטרומה מח העצם והופקד בכבדות במטריקס של מח העצם 31,32 ודגירה של תאים בצפיפות clonogenic בי האינטראקציות שלהם הן ​​בעיקר בתשתית. בעוד מייקרו-סביבת מח העצם הוא הרבה יותר מורכב, מערכת פשוטה זו יכולה להיות בנויה עם מורכבות ככל הוסיפו לפי צורך לשאול שאלות מכניסטית ספציפיות. המודל יכול לשמש כדי להשוות רדום בגידול תאים במספר הדרכים, כוללים טכניקות ביולוגיות תא, טכניקות מולקולריות ובטכניקות vivo. ניתן assayed פנוטיפים סלולריים על ידי מחדש שיבוט, תנועתיותופלישה לומדת 35, גידול nonadherent ייזום היווצרות כַּדוּרִית 36 או על ידי מחקרים פונקציונליים לאינטראקציה עם מייקרו-הסביבה באמצעות נוגדנים ספציפיים לחסימה או פפטידים 7. התפוקה הראשונית של assay clonogenic היא ספירה מספרית של מושבות, או גדל או רדומה, המתרגמת לפוטנציאל clonogenic גדל או רדום של התאים. כפי שנרמז לעיל, מספר רב של משתנים יש פוטנציאל להשפיע על תוצאה זו, שכולם חייב להיות מבוקרת בקפדנות כככל האפשר כדי להניב תוצאות לשחזור. אלה כוללים את המקור של תאים, מספר כולל מעבר, טכניקת הקפאה ואיכות של תרביות התאים שהיו cryopreserved, מספר המעברים מאז הפשרה, נקודת המפגש של תרבויות שמן הכנות התא בודדות התקבלו, המקור ואיכות סרום עגל עוברי, משכי הזמן של trypsinization ושחזורם, המשךשל תאי שמאל בטמפרטורת חדר, המיומנות של pipetting מספרים סלולריים שווי ערך לכל טוב, מיומנות או באופן שווה על פני תאי הפצה את כל פני השטח של היטב, את מספר הפעמים שצלחת יוסר מן החממה לתצפית, בין עשרות אחרים. בנוסף למייצג בקרות איכות תרבית רקמה מקובלת, משתנה אלה ישפיעו על פוטנציאל clonogenic הרדום מניסוי לניסוי. שונות התוך-ניסיוניות היא בדרך כלל פחות מ 8-10%, לעומת זאת, וכתוצאה מכך שינויי אחוז מניסוי לניסוי, כי הם מאוד לשחזור. בדרך כלל, את השונות של הנתונים מתחילה לרדת עם מתאם ישיר של ניסיון מוגבר של הניסוי עם המערכת ואת המשך זמן ביצוע assay זה. ביטוי גנים בתאים רדומים וגוברים ניתן להעריך על ידי RT / PCR, כתם צפון, כתם מערבי, immunoprecipitation ממטרים / מערבי מורכב מערבית ופונקציונלית, Immunofluorescence או אימונוהיסטוכימיה, ריבוב ידי מיקרופלואידיקה, ספקטרוסקופיית ראמאן, cytometry זרימה וטכניקות אחרות. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לקבוע את התפקידים של קולטנים ספציפיים, חלבוני קרום אחרים, מסלולי איתות, גורמי שעתוק, מכפילי היסטון, אברונים וחלבונים במיטוכונדריה, מסלולים מטבוליים וניצול אנרגיה, מתח וכוח ואינטראקציה עם מייקרו-הסביבה באינספור דרכים ב תפקיד של תרדמת. המחקרים הקודמים שלנו הראו תפקידים משמעותיים למסלולי PI3K בהישרדות של שיבוטים רדומים 7, כמו גם בשמירה על הפנוטיפ הרדום עם הפצת אפיתל של אקטין קליפת המוח 15. אנחנו גם הוכחנו כי RhoA במיוחד, חייב להיות מעוכב על מנת שפנוטיפ הרדום להיות מופעל. זאת בניגוד לנתונים שהוצגו כאן, שבו איון של משפחת Rho עם פאן-מעכבים מפחית הישרדות של שיבוטים רדומים. Tהתחתון הסכנה של שימוש במעכבים כימיים לנתח מנגנונים ואת הצורך בשימוש בגישות גנטיות כדי לעכב או להפעיל מסלולים ספציפיים. לצורך זה, המתודולוגיה משאילה את עצמו למניפולציה גנטית של התאים, או על ידי transfection או התמרה קבוע או על ידי transfection החולף 15, siRNA או חלקיקים. מאז assay הוא 6 ימים במשך, ביטוי גנים חולף או הפרעה לזה יגרום לתופעות פנוטיפי משמעותיות ב6 ימים הניתנים למדידה. הכרת הפוטנציאל שלה ללימוד מנגנוני הזנה, כמו גם יציאת תרדמת, אנחנו כרגע חוקרים מנגנונים לתאים אלה לברוח תרדמת. בעוד שנכנס לתרדמת הוא הבין היטב, הבנה של המנגנונים המסדירים את היציאה מהמצב הרדום היא עוד יותר חמקמק. יש לנו דיווח תצפיות ראשוניות שתגובות דלקתיות על ידי סטרומה הפצועה יכולות לתרום להתעוררות של דורmant MCF-7 תאים באמצעות מודל זה 37. המודל יכול להיות מיושם על T-47 תאים, כמו גם, שורת תאי סרטן שד ER + אחרת. בעוד תאי ER- לא להיות רדומים בתגובה לFGF-2, ייתכן שניתן להתאים את המתודולוגיה לסוגי תאי סרטן אחרים עם סוכני בידול שונים בחקירות עתיד. למרות היותו טכניקה שימושית ביותר לזיהוי מנגנון מפתח המעורב בתרדמת, הוא נשאר מודל במבחנה. עם זאת, תאים שעברו תרדמת או במניפולציה מבחנה ניתן לבדוק לגידול xenograft יוצר קיבולת. התועלת הפוטנציאלית העיקרית של המערכת, עם זאת, היא זיהוי של מנגנונים שיאפשר את הפיתוח של השערה שניתן לבדוק בדגמי תרדמת מורכבים ביותר בגוף חי.

תאי סרטן שד גרורות למוח העצם לפני שהמחלה היא 1 לזיהוי, ברגע שגידולים קטנים לפתח כלי דם 2,3. התהליך גרורתי הוא מהיר אבל לא יעיל. תאים להיכנס לכלי הדם החדשים במהירות, במיליון ליום 4 אבל כמה לשרוד את המסע לאיברים מרוחקים 5. עם זאת, כמה micrometastases לשרוד בעצמות ובניתן למצוא כתאים בודדים או גושי תא קטנים בaspirates מח עצם של חולים שאובחנו לאחרונה 1. תאים אלה להתנגד כימותרפיה אדג&#39;ובנט, המנוהלת למטרה מאוד של חיסולם 6. התנגדות זו היא ניחן, באופן משמעותי, על ידי הישרדות איתות ביוזמת אינטראקציות עם מייקרו-סביבת מח עצם 7,8. ניתן למצוא Micrometastases בכשליש מהנשים עם סרטן השד מקומי ומייצג מחוון עצמאי של הישרדות כאשר נותח על ידי ניתוח שונה 9. microme חלקtastases הוא צמיחה יזם, אבל דפוסי הישנות תלויים בסוג התא. חולים עם סרטן השד שלילי משולש נוטים לחזור על עצמה בין 1 עד 4 שנים, המצביעה על שליטה על עניי המצב הרדום. סוגי תאים אחרים, כוללים ER / PR + תאים, יכולים להישאר רדומים במשך עד 20 שנים, עם קצב קבוע, מתמשך של הישנות 10. בעוד הבדלים בחתימות ביטוי גני תרדמת בין ER + וקווי ER- שד תא וגידולים משקפים פוטנציאל תרדמת שונה 11, אינטראקציות עם סטרומה מח עצם עשויים לייצג תרומה משמעותית לתרדמת. המחקר של תרדמת in vivo הוא קשה במיוחד כי micrometastases הם נדירים ועלו במספרם על ידי תאי hematopoietic על ידי יותר מ 10 6 -fold. לפיכך, מודלים רלוונטיים חייבים להיות שנוצרו המספקים נתונים במבחנה שיכול להציע מנגנונים וליצור השערות הניתנות לבדיקת in vivo. מספר דגמי תרדמת, כולל מתמטי עבור מערךמודלים מתמטיים 12,13, במבחנה מודלים 7,8,14,15, המודלים xenograft in vivo 16, שילובים של במבחנה ומודלי xenograft 17,18 ומודלי גידול וגרורים ספונטניים 19, הניבו כמה תובנות תאים סרטניים תרדמת 20 . בכל אחד מהמודלים האלה המגבלות שלהם והם בעצמם בעיקר שימושיים ליצירת השערות בנוגע לאיתות ואינטראקציות ששולטות תרדמת להיבדק במודלים יותר מבחינה ביולוגית מולקולריות רלוונטיים. עם המטרה הכללית של הגדרת המנגנונים המולקולריים של תרדמת, אינטראקציות עם מייקרו-הסביבה שגורמת לעצירת מחזור, redifferentiation והתנגדות ומנגנונים טיפוליים שתגרומנה לחזרה בER + תאים, שפיתחנו מודל במבחנה שמספקת נבחר אלמנטים רלוונטיים של מייקרו-סביבת סטרומה 7. מודל זה, תוך דליל יחסית בcomponents, הוא מספיק חזק כדי לאפשר לחוקרים להפיק מנגנונים מולקולריים ספציפיים המשפיעים על פונקציות משמעותיות של תרדמת. ניסויים אלה ליצור השערות שניתן לבדוק ישירות in vivo. המודל מסתמך על כמה אלמנטים מרכזיים שהפגנו להיות רלוונטי בתרדמת. הם כוללים את השימוש בתאי סרטן השד תלוי באסטרוגן, התרבות של תאים בצפיפות clonogenic בו האינטראקציה שלהם היא בעיקר בתשתית ורכיבים מסיסים של המדיום, תשתית פיברונקטין ואת הנוכחות של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (FGF-2) בטווח הבינוני. אנו מאופיינים מנגנונים ששולטים במערכת במבחנה, כולל האינדוקציה של עצירת מחזור התא על ידי FGF-2 21, בתיווך באמצעות 22 TGFβ, הישרדות איתות באמצעות PI3 קינאז 7,8 וERK 8 ובידול morphogenic לפנוטיפ אפיתל, שהיה תלוי ב איון RhoA, integrin45; 5β1 upregulation וקשירה של פיברונקטין סטרומה הישרדות 7,15 (איור 1). האפקטים במבחנה מחזור תא של FGF-2 על MCF-7 תאים מתחילים בריכוזים יומן אחד לפחות מתחת ל -10 ננוגרם / מיליליטר 21,23. הרציונל היה מבוסס על השליטה הזמנית של FGF-2 ביטוי שלטון המורפוגנזה החלב ductal, הרחבה מחזורית ומיתון במספר מערכות יונקים 24-27. אנחנו הוכחנו כי FGF-2 גורם בידול, כוללים המורפוגנזה ductal בתרבות 3D 28, ושFGF-2 ביטוי, בדרך כלל, איבד עם שינוי ממאיר של גידולים אנושיים 29. הביטוי של FGR1 נותר על כנן בקרצינומה של שד שהשתתף בסקר 29 וMCF-7 תאים ממשיכים לבטא את כל 4 קולטני FGF 30. בהקשר של תרדמת, FGF-2 מיוצאים על ידי ושהופקדו בכבדות על סטרומה מח עצם 31,32 שבו מתפקדת בשימור תאי גזע hematopoietic 33. אנו demonstrated שFGF-2 גורם למצב רדום בתאי ER + סרטן השד בתרבית על substrata פיברונקטין, גם בשפע במוח, שם הוא גורם לבידול morphogenic 7. במודל, תאי סרטן השד הם גידול עכבות, להשבית Rho באמצעות גרף RhoGap, redifferentiate לפנוטיפ אפיתל מחדש מפורש lost α5β1 integrins עם התקדמות ממארת. הם נקשרים פיברונקטין דרך α5β1 integrin ולהפעיל הישרדות איתות שהופך אותם עמידים לטיפול ציטוטוקסיות 7,8,15 (איור 1). עיכוב של GTPases כיתת Rho כבר הוכיח בעבר כדי לגרום פנוטיפ רדום 34. כאן אנו מתארים את הנהלים הספציפיים שיאפשר לחוקרים לקבוע את המודל ולחקור מנגנונים מולקולריים ותאיים ספציפיים המסדירים תרדמת של תאי ER + סרטן השד. בניסויים שהוצגו כאן כדי להמחיש את השימוש במודל, אנו ממוקדים מסלול PI3K (איור 1) עם מעכב Akt ומעכב PI3K וכל בני משפחת Rho (איור 1) עם מעכב פאן-רו וRho קינאז מעכב (סלע).

<table><tbody><tr><td>MCF-7 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>T47D cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-123</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate</td><td>Corning</td><td>354411</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354403</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354451</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin</td><td>Corning</td><td>354088</td><td></td></tr><tr><td>6 Well tissue culture plate</td><td>CellTreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder</td><td>Corning Life Sciences</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum</td><td>Serum Source International</td><td>FB02-500HI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x, Liquid</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF&amp;nbsp;basic</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)</td><td>CalBiochem</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>LY294002&amp;nbsp;</td><td>CalBiochem</td><td>19-142</td><td>Chenical PI3K inhibitor</td></tr><tr><td>C3 transferase&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton</td><td>CTO3</td><td>Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>129830-28-2</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY FL-Phallacidin (green)&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>B607</td><td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td></tr><tr><td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td>Fluorochrome for fibrillar actin staining</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>P-36931</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro dormancy model of estrogen-sensitive breast cancer in the bone marrow: a tool for molecular mechanism studies and hypothesis generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

<html> ניסויים שנערכו כדי לשחזר את assay. במהלך הניסוי הזמן מוצג באיור 2 א. תאים טופחו על צפיפות clonogenic ביום -1, FGF-2 במדיום חדש מתווסף ביום 0 ותאים בתרבית עד שהיום 6 כאשר הם מוכתמים ומושבות נספרות. כל הפרעות למערכת מנוהלות ביום 3 ב100 כרכי μl ב10x ריכוזים סופיים רצוי. איור 2 מדגים את המראה האופייני של מושבות גדלו ורדומות. מושבות גדלו לכלול&gt; 30 תאים ומושבות רדומות מכילות 12 או פחות תאים שהם פעמים רבות יותר גדולות מגידול תאים עם יחס ציטופלסמה / גרעין גדול. איור 2C מדגים תוצאה ניסיונית טיפוסית שנערכה בארבע פעמים. ההפצה העיקרית של תאים ללא תוספת של FGF-2 מיוצגת על ידי שיבוטים גדלו בזמן, בנוכחותו של FGF-2, רובם המכריע של שיבוטים הם רדומים. ontent &quot;&gt; איור 3 הוא דוגמא לניסוי שבו סוכני perturbing נוספו ביום 3. הדמות מייצג את העיכוב תלוי המינון של שיבוטים רדומים על ידי עיכוב של משפחת Rho של GTPases ידי-פאן Rho transferase C3 המעכב ו קינאז Rho (ROCK) מעכב Y27632. assay יכול להעריך ED 50 של מעכבים הוסיפו על שיבוטים רדומים כמו גם שיבוטים גדלו. בניסוי זה, ההשפעה על שיבוטים גדלו לא נקבעה, שכן הוא הוצג רק כדי להמחיש את המתודולוגיה. איורים 4 ו -5 להוכיח כי assay יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות המשולבות של מעכבים על הישרדות של שיבוטים רדומים. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי מסלול PI3K עובר הפעלה מתמשכת בתאים רדומים במודל ועיכוב זה של שני PI3K וAkt חלקי מעכב את ההישרדות של שיבוטים רדומים 7. כאן תצפיות ראשוניות, לא, הפגיןעיכוב ספציפי כובע של משפחת Rho של GTPases הקטן גם באופן חלקי מעכב הישרדות של שיבוטים רדומים. הנתונים מוצגים באיורים 4 ו -5 להראות ששילוב עיכוב של PI3K ואחד effectors במורד הזרם שלה, AKT, עם העיכוב של משפחת Rho עם transferase C3 ומעכב ROCK יכול לחסל את ההישרדות של שיבוטים רדומים בנסיבות מסוימות כמעט לגמרי. אנחנו הוכחנו בעבר כי שיבוטים רדומים שרדו העיכוב של PI3K אבל לא של Akt מורכבים של תאים שכבר לא מציגים את הפנוטיפ הרדום, אלא מופיע mesenchymal ו -7 במצוקה. תאים בשיבוטים רדומים שבמשפחת Rho כבר מעוכבים רחב על ידי transferase C3 ומעכב ROCK גם לאבד את המראה האופייני הרדום, להניח הופעות fibrolastoid וקרומים פרעו וגם מופיעים במצוקה (איור 6). ניסויים אלה מדגימים מודל שניתן שאילתא במאוד brאופן OAD להשיג הבנה של הגורמים הקובעים תרדמת והתנגדות לטיפול. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig1.jpg" /> איור 1: מנגנוני שלטון מודל תרדמת במבחנה שלנו () גידול וMCF-7 שיבוטים רדומים לאחר דגירה 6 ימים בצפיפות clonogenic על צלחות מצופים פיברונקטין עם ובלי 10 ng / ml 7 (הגדלת 100x) FGF2.. סכימת סיכום (ב &#39;) מתארת ​​את הנתונים שFGFR וintegrin α5β1 איתות המצב יציבה המקבילה נדרשה להפעיל ולתחזק תרדמת 7. FGF-2 upregulates מעכבי קינאז התלויים cyclin כתוצאה ממעצר G1 21, מפעיל ERK 8 וPI3 kinase 7 שinitiatesurvival איתות וupregulate integrin α5β1 7, אשר מגיע למצב יציב לאחר מספר ימים. throug איתות הכפולFGFR h דרך PI3K ובאופן עצמאי באמצעות קשירה של α5β1 integrin ידי פיברונקטין נדרש להפעלה של FAK ולוקליזציה קרום והפעלה של RhoA GAP 15 הגרף. התוצאה היא איון של RhoA ומצב יציב מתירנית לסידור מחדש בקליפת המוח של F- אקטין (photomicrograph מוכתם phalloidin), מחדש בידול אפיתל ותרדמת 15. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52672/52672fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig2.jpg" /> איור 2: אלמנטים של assay תרדמת במבחנה סכימה (א) לרכיבים זמניים של assay תרדמת.. תאים מודגרת על צלחות תרבית רקמת פיברונקטין מצופה בצפיפות clonogenic, בצפיפות מקסימלית של 1500 תאים / גם צלחת גם 24 בIncubator על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ביום 1. הבינוני מוחלף ביום 0 עם מדיום חדש או בינוני טרי המכיל FGF-2 10 ng / ml והתאים מחדש מודגרות. תאים הם מוכתמים פתרון סגול גביש, כפי שתואר, ביום 6. כל מעכבים או סוכני ההפרעות מתווספות ביום 3 ב100 כרכי μl ב10x ריכוזים רצויים ותאים מחדש מודגרות עד יום 6. (ב) המראה של מוכתם גדל וMCF-7 מושבות רדומות. מושבות גדלו לכלול&gt; 30 תאים ומושבות רדומות מכילות 12 או פחות תאים. תאים רדומים הם חביתית צורה, גדולים פי כמה מאשר גדל תאים עם יחס ציטופלסמה / גרעין גדול. (ההגדלה 100x). (ג) גרף הממחיש את פוטנציאל clonogenic של 1,500 MCF-7 תאי סרטן אנושיים שד מודגרות עם ובלי FGF-2 10 ng / ml על 24 צלחות גם מצופה פיברונקטין. ללא FGF-2, ההפצה העיקרית של תאים מיוצגת על ידי שיבוטים גדלו בעוד בנוכחות FGF-<html> 2 הרוב המכריע של שיבוטים הם רדומים. ניסויים נעשו בארבעה פעמים. (ברים שגיאה הם + SD) <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig3.jpg" /> איור 3: עיכוב תלוי-מינון של שיבוטים רדומים על ידי הפאן-רו משפחת מעכבי transferase C3 וY27632 מעכב ROCK תאי T-47D הודגרו בצפיפות clonogenic של 1,000 תאים לכל גם על 24 צלחות גם פיברונקטין מצופות עם FGF-2. 10 / מיליליטר ng עבור 6 ימים. תקשורת, Y27632 0.1, 1 או 10 מיקרוגרם / מיליליטר C3 transferase 3 או 5 מיקרוגרם / מיליליטר, ומעכב ROCK היה ביום 3 ושיבוטים רדומים נספרו ביום 6. הגרף ממחיש עיכוב תלוי מינון של שיבוטים רדומים מוכתמים ב יום 6. ED 50 של C3 היה כ 3 מיקרוגרם / מיליליטר ואילו זה של מעכבי ROCK היה בין 1 ל 10 מיקרומטר בassay זה. ניסויים נעשו בארבעה פעמים. (ברים שגיאה הם + SD) jove_content &quot;FO: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52672/52672fig4.jpg" /> איור 4:. השפעות משולבות של הפאן-רו C3 מעכב משפחה עם מעכב Akt או עם מעכבי קינאז PI3 על הישרדות של שיבוטים T-47D הרדומים תאי T-47D הודגרו בצפיפות clonogenic של 1,000 תאים לכל גם ב -24 ופיברונקטין צלחות -coated עם FGF-2 10 ng / ml למשך 6 ימים. 5 מיקרוגרם / מיליליטר מדיה, transferase C3, Akt מעכב 25 מיקרומטר ו -20 מיקרומטר LY294002 נוספו בנפרד או בשילוב ביום 3 ושיבוטים רדומים נספרו ביום 6. ההשפעות המשולבות של C3 ומעכב AKT נראות כתוסף באלה מופיעים ריכוזים אך ההשפעות המשולבות של C3 ומעכב PI3K להיות סינרגטית בניסויים אלה בעיכוב של הישרדות שיבוט רדומה. ניסויים נעשו בארבעה פעמים. (ברים שגיאה הם + SD) <img alt<html> = &quot;איור 5&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,672 / 52672fig5.jpg&quot; /&gt; איור 5:. השפעות משולבות של Y27632 מעכב רוק עם מעכב Akt או עם מעכבי קינאז PI3 על הישרדות של שיבוטים T-47D הרדומים תאי T-47D הודגרו בצפיפות clonogenic של 1,000 תאים לכל גם על 24 צלחות גם פיברונקטין מצופות עם FGF-2 10 ng / ml למשך 6 ימים. תקשורת, מעכב ROCK Y27632 3 מיקרוגרם / מיליליטר, Akt מעכב 25 מיקרומטר וLY294002 20 מיקרומטר נוספו בנפרד או בשילוב ביום 3 ושיבוטים רדומים נספרה ביום 6. ההשפעות המשולבות של Y27632 ומעכב AKT אינו מופיע להיות תוסף בריכוזים אלה, אך ההשפעות המשולבות של Y27632 ומעכב PI3K מופיע ליותר מ תוסף בניסויים אלה בעיכוב של הישרדות שיבוט רדומה. ניסויים נעשו בארבעה פעמים. (ברים שגיאה הם + SD) .jpg &quot;/&gt; איור 6:. ההופעה לשרוד שיבוטים T-47D רדומים לאחר הטיפול בtransferase C3 וY27632 מעכב ROCK מבחני מושבה הוקמו ארבעה פעמים ב -24 צלחות תרבית רקמה גם פיברונקטין מצופים ב 1000 תאים / היטב עם FGF-2, כפי שתוארו, מעכבים נוספו ביום 3 בריכוזים הראו, תאים היו מוכתמים וצילמו ביום 6. תאים שטופלו במעכבי משפחה פאן-רו איבד את המראה שלהם התפשטו, הפך קטן, הדנדריטים והופיע במצוקה. (ההגדלה 100x).

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation at JoVE.co

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

<em&gt; במבחנה</em&gt; תרדמת דגם של סרטן השד רגיש לאסטרוגן במוח העצם: כלי ללימודי מנגנון מולקולרי והשערת דור

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

an-vitro-dormancy-model-estrogen-sensitive-breast-cancer-bone-marrow

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

8.2K Views.  Rutgers New Jersey Medical School. We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo. 

Video: An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Cancer Research

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

מודלים של גרורות עצם

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. Immortalized cell lines are easy to grow and genetically modify to study molecular mechanisms, yet the selective pressure from cell culture often leads to genetic and epigenetic alterations over time. Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully recapitulate the heterogeneity and drug response of human breast tumors. PDX models exhibit a relatively short latency after orthotopic transplantation that facilitates the investigation of breast tumor biology and drug response. The transplantable genetically engineered mouse models allow the study of breast tumor immunity. The current protocol describes the method to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad followed by drug treatments. These preclinical models provide valuable approaches to investigate breast tumor biology, drug response, biomarker discovery and mechanisms of drug resistance.

Patient-derived xenograft (PDX) models and transplantable genetically engineered mouse models faithfully recapitulate human disease and are preferred models for basic and translational breast cancer research. Here, a method is described to orthotopically transplant breast tumor fragments into the mammary fat pad to study tumor biology and evaluate drug response.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video