Name: assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור מעניק AI41816 ו AI099339 (N.E.F.) ועל ידי F31AI094886-01 (P.D.M.) מ NIAID. התכנים הם באחריות המחברים בלבד ואינם מייצגים בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של מקורות המימון.

<ol>
	<li>Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+hot+dogs+to+host+cells:+how+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes+regulates+virulence+gene+expression.">From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression.</a> Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).</li><li>Drevets, D. A., Bronze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+epidemiology,+human+disease,+and+mechanisms+of+brain+invasion.">Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).</li><li>Farber, J. M., Peterkin, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes.+a+food-borne+pathogen.">Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen.</a> Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).</li><li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+Listeria+monocytogenes+targets+and+crosses+host+barriers.">Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers.</a> Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).</li><li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+listeriosis+and+animal+models.">Human listeriosis and animal models.</a> Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).</li><li>Bou Ghanem, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InlA+promotes+dissemination+of+Listeria+monocytogenes+to+the+mesenteric+lymph+nodes+during+food+borne+infection+of+mice.">InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice.</a> PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).</li><li>Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+with+signature-tagged+Listeria+monocytogenes+reveals+organ-specific+growth+and+dissemination+routes+in+guinea+pigs.">Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs.</a> Infect Immun. 80, 720-732 (2012).</li><li>Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+subpopulations+of+Listeria+monocytogenes+with+enhanced+invasion+of+cardiac+cells.">Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells.</a> J Med Microbiol. , (2011).</li><li>Adler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pseudotumor+of+the+heart+caused+by+Listeria+monocytogenes+infection.">Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection.</a> J Infect. 58, 161-163 (2009).</li><li>Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocarditis+due+to+Listeria:+description+of+two+cases+and+review+of+the+literature.">Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature.</a> Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).</li><li>Brouqui, P., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocarditis+due+to+rare+and+fastidious+bacteria.">Endocarditis due to rare and fastidious bacteria.</a> Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).</li><li>Brusch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+infections+in+the+immunosuppressed+patient.">Cardiac infections in the immunosuppressed patient.</a> Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).</li><li>McCue, M. J., Moore, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis+with+microabscess+formation+caused+by+Listeria+monocytogenes+associated+with+myocardial+infarct.">Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct.</a> Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).</li><li>Menard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+calcium+channel+expression+during+retinoic+acid-induced+differentiation+of+H9C2+cardiac+cells.">Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells.</a> J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).</li><li>Czuprynski, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+silage,+sandwiches+and+science.">Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science.</a> Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).</li><li>Grundler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li><li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes.">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).</li><li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart.">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776,+a+cardiotropic+serovar+4b+strain.">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552 (2012).</li></ol>

המחברים מדווחים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

L. מונוציטוגנים הוא פתוגן אנושי נפוץ ומאופיין היטב, המסוגל לגרום למספר ביטויי מחלה שונים15. החיידק תואר בעבר בשל יכולתו לעבור בין מחסומים, כגון מחסום הדם - מוח ומחסומי שליה-עובר, על מנת להגיע וליישב את מערכת העצבים המרכזית ואת העובר המתפתח, בהתאמה. היכולת in vivo של האורגניזם ליישב רקמות אלה הוא השלים לעתים קרובות על ידי יכולת במבחנה לפלוש לתאים המייצגים בתרבות המרכיבים את האיברים ממוקדים. לדוגמה, פלישה של תאי אפיתל מקלעת choroid קושרה עם היכולת של האורגניזם ליישב את מערכת העצבים המרכזית16; ו explants trophoblast villous שימשו כדי לייצג את מחסום אימהי-עוברי17. בפרוטוקול זה תוארו שיטות שימושיות להערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות, כמו גם להשוואת קולוניזציה חיידקית של הלב עבור מבודדים בודדים ביחס לקולוניזציה של הכבד והטחול.
פרוטוקול זה מכיל מספר צעדים קריטיים, אך בין הקריטיים ביותר הם אלה הכרוכים בשימוש ב- CFU החיידקי הנכון לזיהום של תאי תרבית רקמות הגדלים על כיסויים או זיהום של בעלי חיים. אם מספר CFU חיידקי אינו נשלט כראוי בין בארות שונות ובעלי חיים אז השוואות ישירות בין דגימות לא ניתן לבצע. חשוב לבדוק שוב את סדרת הדילול המשמשת ליצירת האינוקולה על ידי ציפוי ישיר של הדילול הסופי על לוחות מדיה על מנת להבטיח כי מספר CFU חיידקי הוערך במדויק.
תאי H9c2 המשמשים מבחנים אלה נגזרים מהמחצית התחתונה של לב עכברוש עוברי 13 יום שכלל בעיקר רקמה חדרית18. התאים להפיץ כמו מיובלסטים mononucleated ועל הגעה מפגש צלושי תרבית רקמות או מנות מתחילים ליצור מבנים צינוריים רב נוקדי. התאים יש זמן הדור של כ 30 שעות18. הרעבה בסרום של תאי H9c2 קושרה עם בידול של התאים לתאי שריר השלד, ואילו טיפול של myoblasts עם 10 nMכל- חומצה רטינואית טרנס נקשר עם בידול מיובלסט לתוך מיוציטים לב14. פרוטוקול זה התמקד L. monocytogenes הפלישה לתאים myoblast, אולם קו התא H9c2 הוא קו תאים רב תכליתי שיכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של בידול תאים מבוקר על פלישת חיידקים.
זן L. monocytogenes 07PF0776 היה מבודד במקור מחולה נגוע ב- HIV שהיה לו מעצר א-סיסטולי שאינו ניתן לחידוש עקב זיהום פולשני L. monocytogenes של הלב8. ניתוח מאוחר יותר של זן זה במודלים של זיהום עכבר הצביע על כך שיש לו יכולת משופרת למקד ולפלוש לרקמת לב. ניתוח מוגבל של מבודדים אקראיים נוספים של L. monocytogenes עולה כי תת אוכלוסיות של מבודדים חיידקיים מסוגלים להדביק את ליבם של עכברים בהיעדר כל נזק קודם רקמת לב או שסתומי לב8. מעניין, שניים מזני L. monocytogenes המאופיינים הטובים ביותר, 10403S ו- EGD, נמצאו כמתיישבים עניים של תאי לב ורקמות. רצף הגנום של מבודד 07PF0776 לא חשף את נוכחותם של איים פתוגניים חדשניים או סיפק ראיות לאשכולות גנים ייחודיים19; זה מרמז כי 07PF0776 מטרות תאי לב לפלישה באמצעות שינוי של הארסנל הקיים שלה של מוצרי גנים ארסית. ניתוח היסטוכימי ראשוני מציין כי 07PF0776 יוצר מורסות בתוך לבבות עכבר נגועים שנראים דומים למורסה שנצפתה בחולה האנושי הנגוע המקורי (נתונים לא מוצגים). אם אחרים קרדיוטרופי L. monocytogenes מבודד לגרום היווצרות מורסה לב דומה נשאר להיקבע.
הבדיקות המוצגות כאן ניתן לשנות בקלות כדי להקל על הבדיקה של היבטים שונים של זיהום. coverslips בודדים ניתן לתקן מוכתם עבור מיקרוסקופיה אור או פלואורסצנטי מבוסס, זמני הדגירה של תרבית הרקמה ניתן להגדיל למדידה והשוואה של חיידקים קצבי צמיחה תאיים, רקמות ואיברים יכול להיות מוטבע פרפין ומעובד לבדיקה מיקרוסקופית כדי לבחון היווצרות מורסה והפצה חיידקית ברמה התאית. בעת הערכת רמות של פלישת חיידקים של תאי תרבות רקמות או קולוניזציה של רקמות מארחות, יש מגבלות במונחים של הכמות המינימלית של חיידקים כל מבחנה יכולה לזהות. במבחנה מבחני פלישה יש גבול נמוך יותר של גילוי של כ 300 CFU לכל כיסוי. התאמת נפח המים המשמשים מערבולת coverslips עשוי לשפר את הגילוי של מספרים נמוכים של חיידקים, עם נפחי תמוגה התא נמוך כמו 500 μl להוכיח שימושי כדי לזהות זנים פולשניים גרוע. Coverslips עשוי להיות טבול לזמן קצר במים סטריליים כדי להסיר ג'נמיסין עודף לפני תמוגה של תאים מארחים בכמויות קטנות יותר. רמות נפח של עד 5 מ"ל או יותר ניתן להשתמש כדי למנות כראוי זנים פולשניים מאוד. בבעלי החיים, הומוגנטים איברים יכולים להיווצר בכמויות של 5 מיליליטר או 10 מ"ל של ddH20, עם כמויות נמוכות יותר להיות שימושי כדי לזהות רמות נמוכות יותר של חיידקים, כמויות גבוהות יותר כדי למנות טוב יותר איברים קולוניאליים בכבדות. טווח הגילוי המינימלי עבור איברים נגועים הוא כ 100 CFU. אם האיברים מתיישבים באופן עקבי ברמות גבוהות, שקול להשתמש בנפח גדול יותר של מים (10 מ"ל) ולבצע דילולים נוספים בתוך צלחת 96-well.
השיטות המתוארות ניתן ליישם על איברים ורקמות מחוץ ללב. מבחני פלישה וזיהומים בעכבר כגון אלה שימשו להערכת קולוניזציה בשלל אתרים, כולל השליה, המוח, כיס המרה, הכבד והמעי. שינויים בפרוטוקולים המתוארים לעיל יכולים להתבצע גם על מנת להתאים זנים hyperinvasive ו / או hypervirulent, והחלפת תאי לב עם סוגי תאים אחרים ניתן לעשות כדי להעריך פנוטיפים פלישה באתרים מחוץ למערכת הלב וכלי הדם. מאז סוגי תאים שונים שינו את הרגישות לפלישה L. monocytogenes, התאמת פרמטרים כגון MOI ואת זמני הדגירה עשוי להיות נחוץ על מנת לשחזר במדויק נתונים מן assays.

ליסטריה מונוציטוגנים הוא פתוגן תאיים גראם חיובי מסוגל לגרום למחלות קשות באוכלוסיות רגישות, כולל קשישים, נשים בהריון, אנשים עם HIV / איידס, ואנשים המקבליםכימותרפיה 1. זיהום באוכלוסיות אלה הוא לעתים קרובות תוצאה של בליעת מוצרי מזון מזוהמים, ורוב הזיהומים קשורים להתפרצויות מזון בקנה מידה גדול2,3. אצל בני אדם ויונקים אחרים, L. monocytogenes הוא מסוגל translocating מעבר לגבול האפיתל של המעי הדק, לאחר מכן מועבר לכבד4,5. מודלים של בעלי חיים מראים כי חיידקים שנבלעו לשכפל בתוך villi מעיים ולעבור לכבד דרך וריד הפורטל או להתפשט דרך בלוטות הלימפה mesenteric לתוך זרם הדם, המוביל הפצה המטוגנית לכבד טחול6,7. בכבד ובטחול, החיידק מסוגל לתווך ספיגה לתוך שני phagocytes מקצועי, כמו גם תאים parenchymal תושב, במהירות קובע זיהומים בתוך איברים אלה. ככל שעומס החיידקים עולה, חיידקים רבים מפוזרים בחזרה לדם, שם הם מסוגלים ליישב עוד יותר רקמות רגישות כולל מערכת העצבים המרכזית ושליה (שם קיים). קולוניזציה של אתרים אלה מונעת את הביטויים הנפוצים ביותר של ליסטריוזיס בבני אדם, כולל דלקת קרום המוח, דלקת המוח, הפלה עוברית2.
אוכלוסיות נבחרות של L. monocytogenes הוכחו לאחרונה יש יכולת משופרת לפלוש ולשכפל בתוך רקמת הלב8. ביטויים של מעורבות בלב הם מגוונים, והם נעים בין אנדוקרדיטיס ודלקת קרום הלב, כדי דלקת שריר הלב fulminant להשלים עם הפרעות הולכה9-13. המספר הכולל של מקרי לב L. monocytogenes בשנה הוא נמוך אבל עשוי להיות תחת הערכה כמו היבט זה של זיהום אינו מוכר בדרך כלל היטב. קולוניזציה של הלב על ידי פתוגנים לעתים קרובות דורש נטייה מארח כגון נזק valvular קיים מראש או שסתומי לב מלאכותיים. ישנם, עם זאת, מבודדים של L. monocytogenes כי זוהו כי הם בולטים ביכולתם ליישב את ליבם של בעלי חיים נגועים בהעדר כל נזק לב ו / או חריגות8.
להלן מתוארים במבחנה ושיטות vivo להערכת קולוניזציה חיידקית של רקמת לב בתוך בעלי חיים נגועים באמצעות מבחני פלישה בתרבית הרקמות, כמו גם זיהומים חיים בבעלי חיים. שיטות אלה הוכיחו שימושי לא רק לזיהוי זנים עם פוטנציאל ליישב רקמת לב בבעלי חיים נגועים, אבל צריך גם להיות שימושי לזיהוי של מוצרי גנים חיידקיים המשמשים כדי לשפר את הפלישה לתאי לב ו / או לגרום לשינויים בפתולוגיה של הלב. שיטות אלה מקלות על השוואת קרדיוטרופיה בין זנים מרובים. עבור השיטות המתוארות כאן, L. monocytogenes 10403S משמש כנציג נחקר היטב של זן שאינו קרדיוטרופי ואת המבודד הקליני 07PF0776 משמש כדוגמה מייצגת של זן קרדיוטרופי. שני זנים אלה נבחרו כדי לספק השוואה לפלישה חיידקית של תאי לב במבחנה ו קולוניזציה של לבבות של עכברים נגועים vivo. הבידוד 07PF0776 הוא מבודד קליני התאושש מורסה בין חדרית שגרמה להפרעות קצב קטלניות בחולה HIV +8. L. מונוציטוגנים מבודדים עשויים להשתנות בפוטנציאל הארסיות שלהם, ובהתחשב בנטייה ליסטריה להדביק אנשים עם דיכוי חיסוני ונשים בהריון, אנשים בתוך אוכלוסיות אלה צריכים לנקוט זהירות תוך הערכת מבודדים קליניים שונים.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Broth Base</td><td>237200</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg of Granulated Agar</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar</td></tr><tr><td>in vitrogen</td><td>LB Broth Base</td><td>12975-084</td><td>2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Coverslips</td><td>12-545-80</td><td>12 mm glass coverslips</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>24-well Tissue Culture Plate</td><td>35-3047</td><td>24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14mL Polystyrene tube</td><td>352051</td><td>14 ml Polystyrene tubes</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96-well U-bottom plate</td><td>35-3077</td><td>Non-tissue culture treated 96-well plate</td></tr><tr><td>Corning</td><td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (High glucose, high pyruvate)</td><td>15-013-CU</td><td>DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen/Strep/Glut Solution</td><td>30-009-CI</td><td>Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-Glutamine</td><td>25005197</td><td>Stock L-glutamine solution without antibiotics</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 Flask</td><td>T1225</td><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture treated flask</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1.5mL microcentrifuge tubes</td><td>2013004</td><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Cardiac Myoblasts</td><td>CRL-1446</td><td>Rat cardiac myoblasts</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SH30070.63</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr></tbody></table>

assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes

ליסטריה מונוציטוגנים הוא פתוגן תאי פקולטטיבי גראם חיובי המסוגל לגרום לזיהומים פולשניים חמורים בחולים immunocompromised, קשישים, ונשים בהריון. הביטויים הנפוצים ביותר של ליסטריוזיס בבני אדם כוללים דלקת קרום המוח, דלקת המוח, הפלה עוברית. סרט המשך משמעותי אך הרבה פחות מתועד של זיהום פולשני L. monocytogenes כרוך בלב. שיעור התמותה ממחלות לב יכול להיות עד 35% למרות הטיפול, אולם מעט מאוד ידוע לגבי L. monocytogenes קולוניזציה של רקמת לב ופתולוגיות וכתוצאה מכך. בנוסף, לאחרונה התברר כי תת-אוכלוסיות של L. monocytogenes יש יכולת משופרת לפלוש ולגדול בתוך רקמת הלב. פרוטוקול זה מתאר בפירוט במבחנה ובשיטות vivo שניתן להשתמש בהם להערכת קרדיוטרופיזם של L. מונוציטוגנים מבודד. שיטות מוצגות לזיהום של myoblasts לב עכברוש H9c2 בתרבית הרקמות, כמו גם לקביעת קולוניזציה חיידקית של לבבות של עכברים נגועים. שיטות אלה שימושיות לא רק לזיהוי זנים בעלי פוטנציאל ליישב רקמת לב בבעלי חיים נגועים, אלא גם להקל על זיהוי של מוצרי גנים חיידקיים המשמשים לשיפור פלישת תאי הלב ו/או לקדם שינויים בפתולוגיה של הלב. שיטות אלה מספקות גם השוואה ישירה של קרדיוטרופיזם בין זנים מרובים L. monocytogenes.

מבודדים נבחרים של L. monocytogenes להפגין פלישה משופרת של תאי לב בתרבית התא במודלים העכבר של זיהום. איור 1 מציג דוגמה לאופן שבו מושבות חיידקים עשויות להופיע בעקבות ציפוי נקודתי של השעיות במדיית אגר. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של CFUs בתוך מדגם מבלי להשתמש במספר גדול של לוחות מדיה אגר. איור 2 מציג דוגמה לתרבית רקמה המבוססת על מבחנים המשווים את היכולת של Strain 10403S לפלוש לתאי לב עם היכולת של זן 07PF0776. יותר מפי שניים 07PF0776 CFU חיידקי ניתן לשחזר מתאי לב נגועים H9c2 בעקבות טיפול גנטמיצין בהשוואה לתאים נגועים 10403S. הבדלים של 2 עד 4-פי נצפו באופן שגרתי עבור זנים קרדיוטרופיים באמצעות בדיקה זו. איור 3 מראה דוגמה להתאוששות של חיידקים מהכבדים, הטחולים והלבבות של עכברים נגועים בגיל 3 ימים לאחר ההדבקה. זיהום של עכברים עם זן cardiotropic 07PF0776 או זן 10403S תוצאות במספרים דומים של חיידקים התאושש הכבדים טחולים של עכברים נגועים, אולם עכברים נגועים 07PF0776 נוטים יותר להניב מספרים לזיהוי של חיידקים מהלב ולהפגין נטל חיידקי גדול יותר באיבר זה.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig1.jpg"> איור 1: דוגמה לטכניקת ציפוי ספוט לקביעת יחידות CFUs חיידקיות. תאי H9c2 שגדלו על כיסויי זכוכית ונדבקו במונוציטוגנים L. היו lysed והמתלים היו מדוללים באופן סדרתי באמצעות 1:10 דילול עד 1:1,000 דילול (פאנל שמאלי). צינור רב ערוצי שימש צינור 10 ul מכל באר ישירות על צלחת אגר LB, ואת הצלחת היה דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס (לוח ימני). מספר החיידקים לכל כיסוי מוערכים על ידי ספירת CFU חיידקי הקשורים לדילול המתאים.
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig2.jpg"> איור 2: L. monocytogenes זן 07PF0776 תערוכות פלישה משופרת של תאי לב בתרבית הרקמות. מבחני פלישה בוצעו בתאי H9c2 באמצעות MOI = 100. גרף מתאר את המספרים הממוצעים של CFUs חיידקי תאיים התאושש +/- SE מתאים נגועים 10403S (שחור) לעומת זן קרדיוטרופי 07PF0776 (כחול). ** מציין משמעות של p <0.01.
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig3.jpg"> איור 3: L. monocytogenes זן 07PF0776 תערוכות פלישה משופרת של הלב במודלים זיהום עכבר. בעלי חיים חוסנו עם 10,000 CFU דרך וריד הזנב. זיהומים הורשו להתקדם במשך 72 שעות, ובשלב זה בעלי החיים הוקרבו והכבדים, הטחולים והלבבות נאספו ומעובדים כדי לקבוע CFU חיידקי לכל איבר. עיגולים מלאים מייצגים את ה- CFU המתקבל מעכברים בודדים, כאשר הערך הממוצע עבור כל בעלי החיים בקבוצה מצוין על-ידי קו +/- SE. ערכי האחוזים מציינים את מספר בעלי החיים המכילים CFU חיידקי הניתן לגילוי בתוך הלב. * מציין משמעות של p <0.05.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes at JoVE.com

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

ליסטריה מונוציטוגנים גורמת לזיהומים עובריים אצל נשים בהריון ודלקת קרום המוח באוכלוסיות רגישות. תת-אוכלוסיות של חיידקים יכולות ליישב רקמת לב, ולגרום לדלקת שריר הלב בחולים ובחיות מעבדה. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד להעריך L. monocytogenes פלישה לתאי לב במבחנה קולוניזציה לב בבעלי חיים נגועים.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

assessing-bacterial-invasion-cardiac-cells-culture-heart-colonization

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

5.4K Views.  College of Medicine, University of Illinois at Chicago. ליסטריה מונוציטוגנים גורמת לזיהומים עובריים אצל נשים בהריון ודלקת קרום המוח באוכלוסיות רגישות. תת-אוכלוסיות של חיידקים יכולות ליישב רקמת לב, ולגרום לדלקת שריר הלב בחולים ובחיות מעבדה. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד להעריך L. monocytogenes פלישה לתאי לב ...

Video: Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

הילוכים אוראלי של<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בעכברים באמצעות בליעה של מזון מזוהם

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

זיהום הניסיון עם<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

ויזואליזציה של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Medicine

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

ליסטריה דלקת של המוח

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates a method to establish an infection model in placental tissues to study infection propagation. An ex vivo placental organ culture is infected with Listeria monocytogenes, a facultative intracellular parasite. The bacteria invade extravillous trophoblasts (EVTs) to enter the placental tissue and then propagate to other cells via cell-to-cell spread.

טכניקה לביסוס מודל זיהום חיידקי בתרבית איברים Ex Vivo

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunopathology

In Vitro Models

Quantification of Bacterial Infection in Host Cells by the Colony-Forming Unit Assay

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video demonstrates an in vitro quantification technique to determine Listeria monocytogenes infection of macrophages by the colony-forming unit assay. The bacterial colonies on the agar plate represent the intracellular bacterial population that escapes the host-defense mechanism and survives within the macrophages.

כימות זיהום חיידקי בתאים מארחים על ידי בדיקת היחידה יוצרת-המושבה

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video ...

Immune Response

Host-Pathogen Interaction

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

ניתוח ציטומטריית זרימה של מונוציטוגנים ליסטריה חוץ-תאיים תוך תאיים ומתפתחים במבחנה

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה

הילוכים אוראלי של

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים

זיהום הניסיון עם

ויזואליזציה של

ליסטריה דלקת של המוח

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

טכניקה לביסוס מודל זיהום חיידקי בתרבית איברים Ex Vivo

כימות זיהום חיידקי בתאים מארחים על ידי בדיקת היחידה יוצרת-המושבה

ניתוח ציטומטריית זרימה של מונוציטוגנים ליסטריה חוץ-תאיים תוך תאיים ומתפתחים במבחנה