Name: functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane at JoVE.c

The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + בחירת הריגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יציבות transfect תאי nhe הלקויים (למשל, הקו-נגזר CCL39 PS120 תא 16) באמצעות כל שילוב של וקטור ביטוי יונקים ושיטת transfection שיפיק תשואות transfection יעילה ובחירה בשורת תאי פיברובלסטים. הערה: במשך שנים רבות משקעים סידן זרח 19 היה בשימוש עם תשואות transfection טובות. זה הוחלף לאחרונה על ידי חומרים כימיים מסחריים כגון Lipofectamine2000, transfections מתבצע הבא הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלושה פתרונות סטרילי כפי שתוארו להלן. לעקר את הפתרונים הללו על ידי סינון (0.22 מיקרומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 + פתרון Loading NH (pH 7.4) המורכב של 50 מ&quot;מ NH 4 Cl, כלוריד כולין 70 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, GL 5 מ&quot;מucose ו -15 מ&quot;מ מגבים ב- pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שטיפה (pH 7.0) המורכב של 120 מ&quot;מ כלוריד כולין, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, גלוקוז 5 מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שחזור (pH 7.4) המורכב של 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתתחיל בבחירה, להשיג תרבית תאי חממה, שניתן להשתמש ב 37 ° C ללא CO 2 נוסף ממכל חיצוני (המכונה CO 2 - חממה &quot;חופשית&quot;), כ5% CO 2 יגרום לחציצה שעלולה לפגוע ב החמצה. להגביר את שורת התאים המבטאת את nhe של ריבית עד לכ 2 x 10 8 תאים (צלחות מ&quot;מ בדרך כלל כ -20 מחוברות 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H + הריגת הליך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים המבטאים את nhe תאיים של עניין במשך שעה 1 בפתרון הטעינה, בשעה 37 מעלות צלזיוס בחממת -חינם CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הטעינה ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים בפתרון מתואר השטיפה מעל. לבצע שלב זה ביעילות לחסל Cl השייר תאי NH 4 שיפגע ביצירת מפל + NH 4 תלול שיפיק את החמצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את מדיום השטיפה על ידי שאיפה ודגירת התאים במשך שעה אחת בפתרון התאוששות שוב על 37 מעלות צלזיוס בחממה החופשית CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את ההתאוששות בינונית עם בינוני תרבות קבועה (בדרך כלל DMEM עם 7.5% FCS) ולגדול תאים בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C באווירת humidified של 5% CO 2 ו -95% אוויר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מחזור של בחירה זו פעמיים בשבוע עד שיבוטים יציבים לצוץ. הערה: קח טיפול מיוחד הנוגע לתרבות התא ותנאי בחירה. חודשים של עבודה יכולים להיות הרוסים על ידי כל זיהום שהוא נוטה יותר לoccur לאחר תקופה של תרבות ומניפולציות תא חוזרות ונשנות ארוכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, לבחור אם להגביר את השיבוטים ולאפיין אותם בנפרד כפי שתואר בסעיפים 2-3 נוסף, או בריכה אותם יחד כדי ליצור אוכלוסייה סלולרית לפני האפיון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בחירה מזדמנת (בערך פעם בשבועיים) כדי לשמר את תאי החמצה עמידה על ידי אלה שאולי חזרו לפנוטיפ החומצה רגישה ההורי (איור 1) בחירה לדלפק. </li></ol> 2. מדידות תאיים pH 2.1) הדמיה pH הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בratiometric pH רגיש BCECF הצבע / AM ניאון, שהוא רגיש pH כאשר נרגש ב 490 ננומטר והוא בעל נקודת 445 ננומטר isosbestic, הבא הפרוטוקולים של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש בבדיקות pH רגיש אחרות, הבאים הפרוטוקולים של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש con הדמיה להגדירsisting של מיקרוסקופ הפוך מצמידים את מצלמת וידאו רגישות גבוהה. לצייד את הסט הזה עם 450 ננומטר ומסנני 490 הפרעות להקת ננומטר צרים יחד עם מסננים ניטראלי צפיפות קוורץ המתאים לעירור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, השתמש בסט המתאים של מסננים ותנאי תאורה לערכי הקרינה דומים התקנה לλ1 וλ2 כך שהיחס מתקרב 1. כמו כן להימנע ערכי הקרינה בסיסיים שנקבעים גם להרוות או נמוך מדי, הן עבור λ1 ו / או λ2. זה עשוי להניב ממצאים חשובים כמו אז היחס לא היה לגילוי למרות pH תוך התאי משתנה. הערה: מערכת זו צריכה לאפשר זלוף המהיר, עירור הזמן לשגות בשני אורכי הגל הנ&quot;ל ורכישה באורך הגל המתאים הפליטה (535 ננומטר לBCECF). לצייד את המערכת עם תוכנה המאפשרת רכישה אוטומטית של נתונים ואחסון. </li></ol></li></ol> 2.2) מדידה של nhe קדימה פעילות (שחול שלפרוטונים מCytosol) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת תאים על ידי דגירה שעה 1 בפתרון NH 4 + טעינה (ראה שלב 1.4) בהעדר CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף BCECF-AM (ריכוז סופי 5 מיקרומטר) לפתרון לחמש דקות האחרונות ולאחר מכן לשטוף אותו עם NH 4 + פתרון טעינה לחסל את החללית תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר התאים במיקרוסקופ ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב. Perfuse פתרון השטיפה (ראה לעיל). התוצאה היא ירידה של הקרינה המתאימה להחמצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייצוב pH, ינקב כל הפתרונות מפורטים להלן למדוד שיעורי החלמה pH בתיווכו של Li + / H +, Na + + / H או K + / H + חליפין. כל פתרון מכיל קטיון צימוד פוטנציאל להיבדק לH + חליפין. אם אחד מאותם מועבר, זה יגרום לעלייה של הקרינה ב495 ננומטר שcorrespond להעלאה בpH התוך התאי: 120 מ&quot;מ LiCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 125 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 </li></ol> 2.3) מדידה של פעילות הפוכה nhe הערה: העיקרון כאן היא להפוך את מפל ריכוזי יונים הטרנסממברני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המדידה, לטעון את התאים עם קטיון תאיים של עניין (ראה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירתם ל5 דקות עם BCECF / AM (ראה שלב 2.2.2); לשטוף אותם, לעלות אותם במיקרוסקופ הווידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse פתרון הטעינה ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייצוב הבסיס, תמונת וריאציות pH כאשר תאי perfused עם מדיום חומציים תאי המכיל 120 מ &#39;כלוריד M כולין, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ MES ב- pH 6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעינת LiCl, דגירה תאים עבור שעה 2 בפתרון המורכב של 120 מ&quot;מ LiCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4. ליתיום תאיים שנמדד על ידי ספקטרום בליעה אטומי מניב ערך של כ -60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לNa + טעינה, דגירה תאים במשך שעות בפתרון המורכב של 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 בנוכחות ouabain 1 מ&quot;מ כדי לחסום את Na / K ATPase. בתנאים אלה, ריכוז Na + תאיים הוא בטווח של 40 מ&quot;מ. הערה: K + טעינה אין צורך כK + ריכוז cytosolic הוא בטווח של 140 מ&quot;מ ושיפוע K + כלפי חוץ מכוון לכן קל להשגה. </li></ol> 2.4) נתונים טיפול וכיול: הערה: שלב זה חל הן על המדידות קדימה לאחור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של כל ניסוי, perfuse תאים עם פתרון של 140 מ&quot;מ KCl, 20 מ&quot;מ HEPES ו -5 nigericin מיקרומטר המותאם לערכי pH בין 6.5 ו -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים כמו מדידות הקרינה מהתמונות (רמות אפורות המייצגים רמות עצימות) ויצוא תחת פורמט טקסט ולטפל כפי שיוסבר להלן באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ערכי pH תוך תאיים לכל תא או אזור של עניין באמצעות המשוואה הבאה בודדים: pH = pKa דקות + (יומן (R-Rmin) / (R מקסימום -R)) x F (λ2) / F מקסימום (λ2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדקות F (λ2) / x ma F יחס אם יש הלבנת בדיקה או דליפה, וכתוצאה מכך ירידה בקרינת 450 ננומטר ברחבי הניסויים (λ2). זה אולם מאוד לעתים רחוקות נצפה בתנאי שימוש בdesניסויי cribed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנתוני כיול נמצאים בסוף כל מדידת pH, לבדוק אם הערכים מחושבים המקבילים שונים מערכי pH המשמשים לכיול. אם זה המקרה, אז להתאים את כל ערכי ה- pH בניסוי שנקבעו לכיול באמצעות ההליך הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המנה הבאה (Q, את ההבדל בין ערכים / ההבדל נמדד בין ערכי הכיול). הכפל את כל המערך על ידי ש הפוך ההתאמה הסופית על ידי הוספה או גריעה כך שהערכים מחושבים יהיו שווים את ערכי כיול המקביל. </li></ol></li></ol> 3. מדידות של מחירים ראשוניים של NHE7 ידי מהיר Li + ספיג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על צלחות גם רב (6 עד 24 גם) ולהפוך לחומצתם או באמצעות NH 4 + טכניקת ההעמסה שתוארה לעיל או לחלופין nigericin אלבומין בסרום שור החמצה / (BSA) תיארה ב -20. </li><li&gt; צלחות לשטוף פעמיים במהירות באמצעות פתרון השטיפה-שתואר לעיל ולאחר מכן דגירה התאים בפתרונות ספיגה המכילים 1-10 ליתיום מ&quot;מ (מעט מתחת לערכי ק&quot;מ) וריכוזים הרצויים של קטיונים ו / או מעכבים של ריבית לסכום הרצוי של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על משך ספיגה קצר ועקבי (בדרך כלל דקה אחת או נמוך יותר) כדי להבטיח תחבורה הפועלת בתנאי שיעורים ראשוניים. כמו כן יש לוודא כי כל הפתרונות המשמשים לספיגה הם איזוטוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זמן הספיגה, לחסל בזהירות בינוני הספיגה ולשטוף את התאים ארבע פעמים עם פוספט קר כקרח שנאגרו (PBS). לבצע שטיפות אלה מהר ככל האפשר (פחות מ -10 שניות לארבעה מהם הוא אידיאליים) כדי למנוע זרימת ליתיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים ב- 25% חומצה חנקתית. החל 250 μl לכל טוב של 25% חומצה חנקתית ולתת לו לשבת במשך שעה לפחות 1, אז גרוטאות היטב עם כל הסוף של קצה פיפטה ולהעביר את כל ההשעיה גם במיל חדשצינור crocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב15,000 XG (טמפרטורת חדר) כדי להסיר את הפסולת התאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את תוכן ליתיום של supernatants ידי ספקטרום בליעה אטומית 21. הערה: חברות שונות מספקות ספקטרומטרים קליטה אטומיים, אשר צריך להיות מצוידים במנורת קתודה חלולה ליתיום. עקוב אחר ההוראות של היצרן מכונה אלה הם מאוד מדויקים, אבל גם די עדינים. </li></ol>

<ol>
	<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway:+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters.">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li><li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H(+)-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis.">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li><li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent's+disease.">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li><li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration.">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li><li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6.">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li><li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+Na+/H++exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation.">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation,+microcephaly,+epilepsy,+and+ataxia,+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome.">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li><li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum.">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain &amp; Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li><li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry.">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li><li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder.">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li><li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+studies+in+ADHD.">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li><li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer's+disease+in+the+ADNI+cohort.">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred.">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li><li>Sardet, C., Franchi, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+primary+structure,+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na+/H++antiporter.">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na+/H++antiporter.">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Na+/H++Exchanger+NHE7+effects+a+Na++coupled,+but+not+K++coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis.">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li><li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes.">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li><li>Lacroix, J., Po&#235;t, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na/H+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens.">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenomic+Effects+of+Cisplatin:+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling.">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li><li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2,+NH3,+and+metabolic+inhibitors.">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-H++exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped,+fluorescent+pH+indicator.">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells.">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li><li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhBG+and+RhCG,+the+putative+ammonia+transporters,+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron.">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li><li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B:+a+new+gas+channel.">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבחור תאים לבטא תאית Na + / H + מחליפי בקרום הפלזמה מבלי לשנות הרצף הראשוני שלהם על ידי מוטגנזה מכוונת. ניתן לאפיין מחליפי האלה עכשיו. שיטה זו מבוססת על הרעילות התאית של פרוטונים תאיים כדי לבחור שורות תאים שתבטאנה Na + / H + מחליפי לפוחי בקרום הפלזמה. זה יכול להיות אפשרי, בעיקרון, לשימוש קטיונים אחרים שעשויים להיות חשוד להיות מועברים, כגון Li +, K +, או Cs +. עם זאת, זה מוסיף רמה נוספת של אי-ודאות. אם הבחירה לא תניב שום שיבוט חיובי, אז זה יהיה קשה להעריך אם קטיון נבדק אינו מועבר או מחליף הוא לא בקרום הפלזמה. מסיבות אלה, בחירות בוצעו באמצעות Na + כקטיון צימוד כמו זה substr תאיאכלתי נמצא בשפע הגבוה ביותר בתנאים פיסיולוגיים. זה הוביל לבחירה של גרסאות מביעות 18 NHE7, כמו גם NHE6 וNHE9 בקרום הפלזמה (משורר וCounillon, תוצאות לא פורסמו). ביטוי זה קרום פלזמה מאפשר המדידה של מובילי פרמטרים תפקודיים בשיטות שיכולים עד כה רק לשמש למובילי קרום פלזמה. כמובן שזה לא ניתן לשלול כי שינוי כזה בסביבת קרום עשוי להשפיע על התכונות פונקציונליות של NHEs לפוחי. עם זאת, אסטרטגיה זו יכולה להיות שווה שימוש לפחות שלוש סיבות: הביטוי תאיים של NHE6 (i), 7 ו -9 מונעים כל מדידה פונקציונלית מפורטת, (ii) סביבות קרום ושותפי חלבון או שומנים בדם ברובם הוכחו להשפיע עדין רגולציה מנגנונים של NHEs האחר ולא תכונות בסיסיות מאוד של מובילים אלה (זיקות לקטיונים צימוד, בררנות, כיווניות, phתכונות armacological). אז זה מאוד סביר להניח כי אלה יישארו ללא שינוי בביטוי של קרום NHEs לפוחי. (Iii) ידיעת המנגנונים התפקודיים ופרופילים תרופתיים של מנגנון לפוחי הביע-קרום פלזמה, אז זה אפשרי לבצע מדידות pH לפוחי להתייחס פערים אפשריים בין אלה קרום פלזמה וביטוי לפוחי. עוד הגבלת פוטנציאל של שיטה זו היא כי האסטרטגיה שתוארה כאן עלולה להוביל לבחירה של תאים לבטא H אחר + extruding מנגנון מאשר לפוחי transfected Na + / H + מחליף (כגון nhe קרום פלזמה, או ATPase H + לדוגמא ). למרות שזה אף פעם לא נצפה במעבדה, זה חשוב אם כן להשתמש תיוג פני תא קלאסי בשילוב להשתקה כדי לוודא שלמעשה nhe של העניין מתבטא אכן בקרום הפלזמה ומתווך + Na או Li + </sעד&gt; זרימת פרוטון + תלויה (ראה למשל Milosavljevic et al. 18). כדי לאפיין את הפעילות של מובילים אלה, שני פרוטוקולים, המבוססים על בהתאמה וריאציות pH תוך תאיות ונתיבי יון מתוארים. השיטה הראשונה דורשת השימוש בבדיקות ניאון pH רגיש ומערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו נאותה. שיטה זו, המשמשת על ידי קבוצות רבות בתחום, פותחה בשנתי ה -1980, באמצעות ראשון fluorimeters למדוד תאי צורת אותות בהשעיה 23, ולאחר מכן באמצעות רכישה דיגיטלית למדידת תאים בודדים על ידי צימוד עירור הקרינה ורכישה לvideomicroscopy 24. הטכניקה האחרונה הפכה כעת מאוד מהירה וקלה, בשל ביצועים הגבוהים של מצלמות, תאורה ומערכות מחשב. מעניין, חברות בדרך כלל מספקות גיליונות טכניים מאוד אינפורמטיבי יחד עם בדיקות הניאון שלהם. וריאציות pH אלו מספקות מידע חשובכדי לקבוע את האופי של קטיונים תאיים בשילוב עם זרימת פרוטון. בהקשר זה, חשוב לשים לב כי משך preincubation אמוניום צריך להיות מותאם בקפידה בהתאם לתאים המשמשים למדידות. fibroblasts הנגזר CCL39, תומך היטב טעינת שעה אחת עם 50 מ&quot;מ NH 4 Cl. התוצאה היא החמצה חזקה מאוד, המאפשרת הפעלה מלאה nhe ומייצרת איתות חזקה למדידות (תנאי Vmax). עם זאת, תאים אחרים כמו שריר לב או תאי כליה עיקריים לא יתמכו טעינת אמוניום חשובה כזה. ראוי ביצוע כמה ניסויים ראשוניים עם זמני דגירה שונים או NH 4 Cl ריכוזים. הסיבה להבדלים כאלה ברגישות לNH 4 Cl אינה ברורה. הם עשויים להיות קשורים לביטוי האפשרי של מערכות תחבורת אמוניום 25,26. בדומה לכך הפתרון ללא נתרן המשמש לשטיפת פתרון הטעינה עשוי שלא להיות נסבלעל ידי תאים, כגון cardiomyocytes למשל. למרות מהירויות ראשוניות ייקבעו פחות בדיוק, יש צורך תנקב ישירות עם פתרון ההתאוששות לאחר טעינת אמוניום. בנוסף, מדידות pH תוך תאיות גם מספקות דרך פשוטה כדי לחקור את התכונות הפיכה של מחליפי אלה כמצב ההפוך יהיה לייצר החמצה שתזוהה בקלות על ידי ירידה ברמת הקרינה BCECF שיכול לבוא לידי ביטוי בכיול הבא ערכי pH . המגבלות של ניסויים אלה היא חוסר כימות מדויק של פעילויות תחבורה, כמו וריאציות pH מידת ניסויים, הפועלות על סולם לוגריתמים ומוגבלים על ידי יכולת חציצה תאית. ניתן למדוד האחרון ווריאציות pH מוכפלות ובנתיבי יון תשואת קיבולת חציצה. עם זאת, תהליך זה משלב כמה שגיאות ניסיוניות (על מדידות pH, מדידות קיבולת חציצה, וcalibration), ולכן הוא לא כמותי מאוד. לפיכך כדי לגשת לקבועים האנזימטית של קרום הפלזמה הביע טרנספורטר, טכניקות שטף יון מהיר הן הרבה יותר פשוט ומדויק. בגלל תכולה תאית היא בטווח millimolar, איתור שינויים בתיווך nhe בנתרן cytosolic אינו אפשרי. מעתה והלאה, במשך שנות טכניקות כגון ספיגה התבססו על שימוש ברדיואיזוטופים כגון 22 Na +. כתב יד זה מתאר שיטה שאינה רדיואקטיביים אשר 22 Na + הוא הוחלף על ידי ליתיום, המבוססים על הרציונל שקטיון זה המשמש גם על ידי NHEs, נעדר מcytosol התא וניתן למדוד בדייקנות רבה באמצעות ספקטרומטריית קליטה אטומית 21. ברגע שהתנאים המתאימים (זמן וריכוז ליתיום) כדי למדוד uptakes ליניארי (כלומר., להיות בתנאי שיעורים ראשוניים) נקבעים, זיקות לקטיונים צימוד פוטנציאלי האחרים ו / אומעכבים ניתן מדד במדויק כפי שמוצגים איורים 3 ו -4. הגבלת פוטנציאל האחרונה היא ששיטת ספיגת ליתיום יכולה כמובן רק לתפקד אם מחליף של עניין משלוחי קטיון זה באופן משמעותי. אם זה לא המקרה, הניסוי יצטרך להסתמך גם על מדידות pH התוך התאי הנ&quot;ל או יצטרך להשתמש ספיגת נתרן רדיואקטיביים. כגון סט של ניסויים הוביל, הביא לאחרונה לתצפית שNHE7 Na + תאיים / H + מחליף, אשר בתחילה היה ככל הנראה H + / K + טרנספורטר שalkalinize שלפוחית ​​הייתה למעשה מנגנון החמצת endosomal מצמידים נתרן 18. יש לכך השלכות עמוקות לתאים תאיים כעד כה תפקיד זה נחשב ליוקדש ל+ ATPases VH. כמו כל חבר במשפחת nhe מופיע להציג o חתימה הקינטית מאוד ספציפיתאגף לתפקיד הפיזיולוגי שלה, זה מפתה לשער שהאפיון של NHE6 וNHE9 באמצעות השיטות המתוארות במאמר זה יחשוף את רומן ותכונות בלתי צפויות שידגיש פונקציות הפיזיולוגיות שלהם.

רוב התאים תאיים להציג pH luminal חומציים, שהוא פרמטר מרכזי להתבגרות, סחר, מחזור של חלבונים או הורמונים ונוירוטרנסמיטורים טעינה. הוכח כי שיפוע pH בין תוכן cytosol ולפוחי מופק על ידי H vacuolar + ATPases 1, מצמידים את מובילי כלוריד CLC לפוחי 2. שניהם בנוק-אאוט (KO) עכברים וחולים אנושיים, את החשיבות של מובילים אלה כבר מסומן על ידי פנוטיפים הכבדים הנגרמים על ידי מוטציות בגנים שלהם 3-6. בני משפחת SLC9A מחליפי נתרן-מימן, המכונים גם NHEs לNa + / H + מחליפי, הוכח להיות effectors מפתח בpH התוך התאי ורגולצית נפח תא, כמו גם בתחבורה וקטורים שווים חומצה-בסיס על פני epithelia . חוץ מזה NHEs קרום פלזמה, שלוש שמורים ביותר Na + / H + מחליפי, 6 nhe, 7ו -9 באים לידי ביטוי ברשת טרנס-Golgi ובendosomes מוקדם 7. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם הפרעה כמו-Angelman או כריסטנסן תסמונות 8-9, אוטיזם מבוסס משפחה 10 וקשב וריכוז והיפראקטיביות 11-12. מחליפי אלה גם היו מעורבים בבעיות ניווניות כגון אלצהיימר רגישות מחלה 13 וגנים רציפים פיגור שהכלי X צמוד תסמונות 14. יחדיו, מחקרים אלה מדגישים את החשיבות של NHEs תאיים אלה בהתפתחות מוח ו / או פונקציה. הלוקליזציה תאית של מחליפי אלה מונעת מדידות מדויקות של הסלקטיביות יונם, כיוון תחבורה, פרמטרים הקינטית, ורגולציה. כמו במקרה של כל המובילים באו לידי ביטוי בתאים תאיים, שקשה מאוד להעריך פעילות ביוכימית שלהם ומכאן להבין באופן מלא התפקידים הפיסיולוגיים שלהם וmechanהאיזמים בסיס ההשלכות פתולוגיות שלהם. בהתבסס על ריכוז K + הגבוה cytosolic, ההשערה ביותר המקובלת היו שהם עובדים כמובילי פרוטון בזרימת בשילוב K +. קיומה של נזילה כזו פרוטון ששער, כפי שהוא עשוי לאזן שאיבת פרוטון על ידי V-ATPases על מנת לשמור על pH לפוחי מצב יציב. מטרת מאמר זה היא חזותי (i) להפגין שיטה המאפשרת את הבחירה הגנטית של שורות תאים המבטאות את מובילי לפוחי כזה בקרום הפלזמה שלהם, וכן (ii) להציג שתי גישות עצמאיות כדי למדוד את הפונקציות של מובילים אלה. לפני שלושה עשורים, Pouysségur וFranchi יש חלוץ גישה גנטית שאפשרה שיבוט ואפיון המולקולריים של בני משפחת nhe 15. זו התבססה על הרעילות של פרוטונים תאיים כשיטת הקרנה. הצעד הראשון היה להשיג שורות תאים לקוייםבכל בורסה + / H + Na הביע בקרום הפלזמה, באמצעות ההפיכות של טרנספורטר זה. Fibroblasts (קו תא CCL39) היה מראש עם Na + או Li + ולאחר מכן הניח במדיום תאי חומצי (pH 6.5) עבור שעה 2. זה הוביל למותם של תאים לבטא Na + / H + חילופי פונקציונליים ולבחירה של תאי antiporter לקוי (קו תא PS120) 16. כשטפח במדיום ללא יקרבונט, תאים אלה רגישים מאוד להחמצה תאית אקוטית. כתוצאה מכך, הביטוי של כל מנגנון זרימת פרוטון פונקציונלי בקרום הפלזמה ייבחר באופן חיובי (ראה 17) אם תאים אלה מוגשים לacidifications תאית האקוטי. טכניקות החמצה כזו יכולה לשמש כדי לבודד שורות תאים עם סחר בפגמים המאפשרים ביטוי בכפייה של NHEs תאית WT בקרום הפלזמה. כאוקריוטים Na + / H+ מחליפי הם electroneutral, הם לא ניתנים למדידה על ידי גישות אלקטרו שנוצלו בהצלחה רבה כדי למדוד ערוצים. כתב-יד זה ולכן מדגים כיצד למדוד את הפעילות של מחליפי זה על ידי מדידות pH תוך תאיות וקינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. כמושגי יסוד הם אותו הדבר, זה מעניין לשים לב שרבים מהתהליכים שפותחו עבור סעיף הבחירה משמשים גם ישירות למדידות פונקציונליות. מעניין, יש לנו ציינו כי פגם הסחר הנוכחי בשורות התאים שנבחרו בגישה שתוארה בכתב היד הזה מוביל לביטוי גדול יותר של חלבוני לפוחי אחרים בקרום הפלזמה כגון ערוץ אשלגן לפוחי TWIK1 18. זה מצביע על כיוון הבחירה של מנגנון פגם שימור כללי לחלבונים הטרנסממברני לפוחי. מכאן הליך בחירה זו והתאים שמייצרים מאימהווה כלי מבטיח לקהילה המדעית עובדת על חלבוני הקרום של תאים תאיים. כמו גם שיטות המדידה שהוצגו כאן עשויות להיות ישימות ללימוד מובילים שאינם electrogenic אחרים.

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

החמצת endosomal היא קריטית עבור מגוון רחב של תהליכים, כגון מחזור חלבון והשפלה, הפחתת רגישות הקולטן, וטעינת מוליך עצבי בשלפוחית ​​סינפטית. החמצה זו מתוארת בתיווכה של ATPases פרוטון, מצמידים את מובילי כלוריד CLC. מאוד-נשמרים מובילי פרוטוני electroneutral, Na + / H + מחליפי (nhe) 6, 7 ו -9 גם באה לידי ביטוי בתאים אלה. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם מחלות ניווניות קוגניטיביים ואנושיות. באופן פרדוקסלי, את תפקידם להישאר חמקמק, כמו הלוקליזציה תאית שלהם מנעה אפיון פונקציונלי מפורט. כתב יד זה מראה שיטה לפתור את הבעיה הזו. זה כולל את הבחירה של שורות תאים שעברו מוטציה, מסוגלת לשרוד החמצת cytosolic חריפה על ידי שמירת NHEs תאית בקרום הפלזמה. לאחר מכן הוא מתאר שני פרוטוקולים משלימים כדי למדוד את הסלקטיביות היון ופעילותשל מחליפי הבאים: (i) המבוסס על מדידות pH תוך תאיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו, וכן (ii) המבוסס על קינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. ניתן להסיק פרוטוקולים אלה על מנת למדוד מובילים שאינם electrogenic אחרים. יתר על כן, הליך הבחירה שהוצג כאן מייצר תאים עם הפנוטיפ פגום שימור תאיים. לכן תאים אלו יהיו גם להביע את חלבוני קרום לפוחי אחרים בקרום הפלזמה. האסטרטגיה הניסיונית המתוארת כאן עשויה לכן מהווה כלי רב עוצמה פוטנציאלית ללמוד חלבונים תאיים אחרים שלאחר מכן באו לידי ביטוי בקרום הפלזמה יחד עם לפוחי Na + / H + מחליפי המשמשים לבחירה.

בחירה: הבחירה + הורג H מבוססת על דיפוזיה של הבסיס החלש אמוניום, כמתואר באיור 1 א. ההשפעה של בסיסים חלשים ודיפוזיה חומצות על pH תוך התאי כבר חלוצה ידי וולטר בורון ומשתפי פעולה 22. הרעיון האלגנטי להשתמש בתופעה זו כדי לייצר החמצה קטלנית לבחירה גנטית חיובית אז שפותחה על ידי ז&#39;אק Pouysségur 17. תחת פרוטוקול כזה, pH התוך התאי יורד ל 5.5 לאחר שלב השטיפה. תאים שאינם מבטא nhe פונקציונלי בקרום הפלזמה לא יכולים לשחזר את ערך ה- pH ניטראלי ולהראות היבט acidified טיפוסי עם צורה שטוחה וcytosol פרטנית (איור 1). מחזורי בחירה חוזרות ונשנות אחרי (כשתי + H הרג נהלים / שבוע), תאים שמלאים ביציבות לשרוד החמצה זו (איור 1 ג) עולה, בתדירות של כ -10 -7.זה יגרום להיווצרות של שיבוטים סלולריים בודדים שניתן לאפיין באופן אישי או או יקוו להשיג אוכלוסיות סלולריות אם תרצה בכך. ניתן לבצע ניסויים סטנדרטיים כגון biotinylation פני תא או השתקת RNA לשלוט שהחלבון ביטא בקרום הפלזמה הוא אכן תאית nhe כגון NHE7 (ראו למשל Milosavljevic et al. 18). כמו גם, RT-PCR וסדר הבא צריכים להתבצע כדי לבדוק מוטציות סופו של דבר ברצף של NHEs תאית בא לידי ביטוי בשורת התאים שנבחרה. אפיון פונקציונלי: הקרינה Videomicroscopy: סלקטיביות הפעילות ויון של NHEs תאית ביטא בקרום הפלזמה יכולה להיות מאופיינת על ידי מדידת השינויים ב- pH תאית הנגרמת על ידי NHEs אלה בתנאים שונים. לשם כך ערכת videomicroscopy מצוידת בתאורההגדרות רכישת ד לתמונת בדיקה ratiometric כגון BCECF / AM היא schematized באיור 2 א. איור 2 ו2C להראות וריאציות טיפוסיות בערכי הקרינה ישירות מתקבלים עבור עירורים ב490 ו -450 ננומטר, הבא 4 +. 2D איור טעינת החמצת NH מראה את עקומת ה- pH שהתקבלה מהערכים אלה הקרינה לאחר טיפול המופיעים ב2.4). ליתיום ספיג: יחד עם מימן ונתרן, ליתיום כולל חלק מהטור הראשון של הטבלה המחזורית והוכח להיות קטיון צימוד יעיל לNa + / H + מחליפי. אפשר לנצל את המידע הזה לקינטיקה מהירה התקנה של ספיגת ליתיום, על מנת למדוד בפרטי הפרמטרים התפקודיים של Na + / H + מחליפי. כקטיון זה נעדר מהציטופלסמה של תא, הצטברותו על CYTהחמצת osolic כמותית תשקף את הפעילות של קרום הפלזמה nhe. יתר על כן, ננו-מולר לריכוזי picomolar של ליתיום ניתן למדוד בדייקנות רבה באמצעות ספקטרומטריית קליטה אטומית. לפיכך, גישה זו היא חזקה מאוד בשילוב עם מבחר של מחליפי לפוחי הביעו קרום פלזמה. איור 3 ממחיש את פרוטוקול המדידה מתואר ב3) לסעיף הפרוטוקולים. תאים, שנזרעו על צלחות מרובות רצוי היטב (6 עד 24) הם acidified כפי שתוארו לעיל. הקינטית מתחיל בדגירה של התאים במדיום המכיל ליתיום, וקטיונים האחרים או מעכבים של העניין (איור 3 א). כדי לעצור את הספיגה, תאים ולאחר מכן הוגשו לארבע שטיפות מהירות בPBS קר כקרח. הפועל במהירות מסיר את כל ליתיום תאי, תוך הבטחה כי אין בזרימת ליתיום משמעותית מתרחשת (איור 3). ריכוז ליתיום בכל טוב הוא אזנמדד באמצעות ספקטרוסקופיה האטומית קליטה (איור 3 ג), ושיעורים ראשוניים של ספיגת ליתיום, אשר ישירות להניב הפעילות של מחליף במצב יציב מתקבלים כמדידות שיפוע כמובן זמן הצטברות ליתיום (איור 3D). באשר לקינטיקה אנזים, מנה-תגובה של שיעורים ראשוניים ניתן להשתמש כדי לגזור ערכי ק&quot;מ למצעים (איור 4 א) של ערכי קי למעכבים. תכונה מעניינת של מובילים היא שקטיונים צימוד שונים יתחרו על הובלה. זה מניב האפשרות של מדידת ק&quot;מ לנתרן בתחרות עם ספיגת ליתיום (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig1.jpg" /> איור 1: בחירה של תאים לבטא תאית Na + / H + &lt;/ Strong&gt; מחליף בקרום הפלזמה שלהם. () אסטרטגיה לשלושה השלבים H + בחירת הרג של תאים לבטא nhe תאיים-מוטציה שאינה ושאינם מתויג פונקציונלי בקרום הפלזמה. תמונת מיקרוסקופ לעומת (B) שלב של תאים הוריים PS120 הוגשו לעומס חומצה. בר סולם: 25 תמונה מיקרוסקופית מיקרומטר ניגוד (C) שלב של תאי PS120 נבחרו לביטוי של מחליף לפוחי בקרום הפלזמה, הבאים עומס חומצה. בר סולם: 25 מיקרומטר <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig2.jpg" /> איור 2: מדידות pH תאית עיקרון (א) למדידת videomicroscopy pH.. E (B)<html> volution של הקרינה הנפלטת (595 ננומטר) של חללית pH BCECF הבאה עירור ב 490 ננומטר. L: עומס חומצה, הר&quot;י; יש לשטוף, הנדון: התאוששות, Cal6.5: כיול בpH תוך תאי של 6.5, Cal7.0: כיול בpH תוך תאי של 7.0 (C) אבולוציה של הקרינה הנפלטת (595 ננומטר) של חללית pH BCECF הבא עירור ב 450 ננומטר. L: עומס חומצה, הר&quot;י; יש לשטוף, הנדון: התאוששות, Cal6.5: כיול בpH תוך תאי של 6.5, Cal7.0: כיול בpH תוך תאי של 7.0 (D) אבולוציה של pH התוך התאי מחושב מיחסי הקרינה 490/450 nm של pH BCECF בדיקה ומנקודתי הכיול. L: עומס חומצה, הר&quot;י; יש לשטוף, הנדון: התאוששות, Cal6.5: כיול בpH תוך תאי של 6.5, Cal7.0: כיול בpH תוך תאי של 7.0 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> her.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig3.jpg" /> איור 3:. פעילות nhe שנמדדה על ידי שיעורים ראשוניים של Li + ספיגה (- C) תכנית המתארת ​​את השלבים קריטיים השונים של דוגמא טכניקת מדידה (ד &#39;) של מהלך זמן מדוד של ספיגת ליתיום לNHE7 מחליף לפוחי הביעה בפלזמה קרום. שים לב ליניאריות של הקינטית בתנאי הניסוי, על מנת להבטיח מדידת שיעורים ראשוניים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig4.jpg" /> עקומות אופייני מנה-תגובה לNHE7 (נתונים מקוריים מ -18): איור 4.שיעורים ראשוניים של ספיגת ליתיום נמדדו באמצעות קינטיקה 1 דקות. עקומת מנה-תגובה ליתיום-תאי (). תחרות (B) של ריכוזים שונים של נתרן תאי על ספיגה תאית ליתיום 1 מ&quot;מ. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52453/52453fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane at JoVE.c

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K Views.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

Video: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Biochemistry

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

סיכום של Curve ערוץ IV יון באמצעות רכיבי תדר

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Neuroscience

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Ion Exchange

Ion exchange chromatography separates charged molecules from a solution by reversibly exchanging them with mobile, or &#39;active&#39;, ions associated with the oppositely charged stationary phase. This method can be used to separate ions, soften and deionize water, and purify solutions. The polymers comprising the ion-exchange column are high-molecular-weight and chemically stable polymers, crosslinked to be porous and essentially insoluble. They are also functionalized with either acidic or basic groups. When functionalized with acidic groups, the columns or resin are known as cation exchangers and contain negatively charged polymers with positive counter ions. These allow cations to be exchanged from the mobile phase. When functionalized with basic groups, the columns or resin are known as anion exchangers, which contain positively charged polymers with negative counter ions and exchange anions from the solution.
During ion exchange, the counterions associated with the solid-phase polymers enter the solution while ions from the solution interact with the polymer in their place. Note that the ability to exchange ions increases as the extent of cross-linking increases and the number of ion-exchange groups increases in the polymer. This exchange is reversible and continues until equilibrium is established.
Acid cation exchangers can be functionalized with either strong acids, such as sulfonic acid (&#8722;SO3H), seen in polystyrene sulfonic acid, or weak acids, such as carboxylic acid (&#8722;COOH), seen in poly(methyl methylacrylic) acid. Similarly, anion exchangers are classified as either strong or weak. Strong anion exchangers often contain quaternary ammonium groups (&#8722;CH2N(CH3)3+), such as those in polystyrene quaternary ammonium chloride, and weak anion exchangers are often functionalized with substituted amines (&#8722;NH3+), such as those in polystyrene tertiary amine hydroxide.

אפיון פונקציונלי של Na

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video