המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של המעבדה המלאי: מינג-Min לי, קתרין Plichta, ויקטוריה מירנדה-תומפסון וסם-קיו קים על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0840932 וIOS-0724978 לצילומי SP

.1 בvivo גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים Symboitic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך צלחת פטרי פלסטיק 100 x 15 מ&quot;מ ומניח את שני דיסקים של נייר סינון (90 מ&quot;מ) במכסה של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר באופן שווה 1 מ&quot;ל של ההשעיה IJ (קטינים מזהמים) מים (בריכוז של 1,000-2,000 IJ / מ&quot;ל) על נייר הסינון. הערה: IJS לא צריך להיות מעוקר לפני שטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 זחלי instar האחרונים של mellonella Galleria waxmoth הגדול יותר לצלחת. המטרה היא לספק כ 100-200 IJS / זחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את המכסה עם החלק התחתון של צלחת פטרי (איור 1) ולתייג את צלחת פטרי. להזכיר את המידע הבא: שם מין נמטודות (אם ידוע); לבודד קוד / ייעוד; מלכודת זיהום נקבעה מועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת, בתוך שקית פלסטיק אטומה באופן רופף (כדי לחסוך בלחות) ולשמור אותו בחושך בבית או בטמפרטורת חדר או באינקובטור בין 20-25 ° C. הגעה מנות יומית הערה: חושך מאפשר זיהום נמטודות, כפי שהוא מחקה תנאי זיהום טבעיים באדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3-5 ימים, להסיר את הגופות עם סימנים של זיהום נמטודות למלכודת לבנה שונה 7. הערה: אם הגופות להריח רקוב, זה עשוי להיות סימן לכך שculturing לא היה מוצלח ו / או לא היה זיהום. הגדר קאמרי זיהום חדש עם קבוצה חדשה של נמטודות וחרקים. </li></ol> .2 במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים סימביוטיים שלהם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבד כליות אגר שיטה 9,19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים כבד וכליות לחתיכות קטנות (2 סנטימטר 3 או קטן יותר) ומקום לבלנדר עם NaCl, אגר ו300 מ&quot;ל של מים ותערובת עד שהבשר הופך לעיסה נוזלית, דבק או פירה סמיך. לאחר מכן, להעביר את התערובת לבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את 200 מ&quot;ל הסופי של מים לספינת הבלנדר ולמזוג כל מדיה שנותרה לבקבוק Erlenmeyer. החיטוי במשך 15 דקות ב 121 C °. לאחר המעוקר לאפשר אגר להתקרר לגעת לפני המזיגה. הערה: Pipetting של מדיום אינו מומלץ משום שהמדיום הזה נוטה להיות נתחי בשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ~ 20 מ&quot;ל של אגר על 5 סנטימטר צלחות פטרי (או 6), בעוד יד ערבוב או מתערבל בקבוק Erlenmeyer בין מוזג לתקשורת הומוגני יותר. לאפשר אגר לביסוס ומנות לאחסן ב 4 ° C עד צורך הערה: השתמש במרית מתכת מעוקרת להבה כדי לשבור את כל נתחים גדולים של בשר שפכו לתוך צלחת פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומנים אגר שיטת 9,19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום אגר שומנים על ידי ערבוב יחד מרק מזין, תמצית אגר ושמרים ויוצקים לערבב לתוך בקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. הוסף מזוקק H 2 O וMgCl 2 • 6 שעות 2 O וחיטוי ל15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תערובת עקרה של תערובת שמן וסירופ תירס תירס ומערבבים או מערבולת במרץ, ולעתים קרובות לפזר טיפות שמן באופן שווה. <br/&gt; הערה: לעקר שמן תירס וסירופ על ידי הצבת הנפח הדרוש בצולב מקשר UV. השמן לא מתמוסס לתוך הנוזל, אבל לוודא שהוא בטיפין זעירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ~ 20 אגר מ&quot;ל על 5 סנטימטר צלחות פטרי (או 6) ולאפשר אגר לביסוס ומנות לאחסן ב 4 ° C עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak רצוי חיידקים סימביוטיים על הצלחת אגר שומנים ודגירת צלחות ב28 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעה. הערה: מורחים 100-200 μl של תת הלילה (12-16 לשעה) LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום אחרי, להוסיף כ 0.4 מ&quot;ל של השעיה משטח מעוקר נמטודות (ביצים או קטינים מזהמים) ודגירת צלחות בטמפרטורת חדר בחושך או בחממה ב22 ± 3 מעלות צלזיוס. הערה: אל תוסיף יותר מ 0.4 מ&quot;ל של ההשעיה נמטודות כפי שהוא יכול ליצור סביבת יתר על המידה רטובה שהיא שלילי לצמיחת נמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תרבויות יומי. תרבויות צריכה לייצר דור חדש של IJS בכ -12 ימים (איור 2).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלחת תחתית עם אגר כאשר נמטודות נראית זחילה הצדדים של הצלחת (איור 3 א) למלכודת לבנה שונה (ראה אל אורוסקו et. 12) למסוק IJS (איור 3 ב). לבצע שלב זה תחת הזרימה למינרית להפחתת זיהום מכלי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף IJS מהמלכודת הלבנה שונה על הופעתה ולשטוף השעיה IJ כדי להסיר כל פסולת בינונית. חנות IJ במעוקר מים מזוקקים ב10 ° C (בחממה קרה בטמפרטורה או בחדר קר) או להשתמש באופן מיידי במידת הצורך. הערה: בהתאם למטרת המחקר, זרע הצלחות גם עם נמטודות-יישב הסימביונט או aposymbiotic. </li></ol></li></ol> .3 במבחנה הגידול של Aposymbiotic (הסימביונט-חינם) Entomopathogenic נמטודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק 10-20 G. זחלי mellonella עם IJS של מיני נמטודות הרצויות (ראה סעיף 1). אחרי 3 או 4 ימים (בשלב זה IJS צריך הבשיללמבוגרים דור הראשונים) לאסוף גופות. הערה: זמן לפדיון ומספר הנקבות הדרושות כדי להשיג מספר מספיק של ביצים משתנית בהתאם למינים. להדביק עוד G. mellonella זחלים במידת צורך ולהתחיל והניתוחים מוקדם ככל לאחר זיהום 48 שעות כדי להעריך אם הן נמצאות בשלב התפתחותי תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל גופה בנפרד בצלחת פטרי עם תמיסת מלח (חיץ M9 18). לנתח גווייה על ידי משיכת ראשו עם מלקחיים קצה קנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 20 הרה להולדת (עם ביצים בפנים) נקבות עם מחט דקה (L-צורה רצוי) ולמקם אותם בזכוכית שעון המכילה 10 מ&quot;ל של חיץ M9 (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון axenizing על ידי בהתחשב את המרכיבים הבאים: 6.75 מ&quot;ל מים מזוקקים, 1.25 מ&quot;ל 5 N NaOH, ו2.25 מ&quot;ל פתרון אקונומיקה זמין מסחרי בדילול מלא להיפוכלוריט 3%. הערה: NaOH הוא פתרון כפפות, משקפי מגן בסיסי ואחרים מתאים מגןבגדים צריכים להיות משוחק. הערה: הכן פתרון axenizing טרי בכל פעם, כמו אקונומיקה מדרדרת באור. הכן כמה קבוצות של פתרון axenizing ולבצע עיקור המשטח וקציר של ביצים במשקפיים שעון מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את נקבות לפחות שלוש פעמים עם חיץ M9 מילוי זכוכית שעון עם פתרון חיץ ומתחנף חיץ עם טפטפת. ודא הנשים יישארו בזכוכית השעון. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף את פתרון axenizing ולאפשר את הנקבות להישאר בפתרון זה עבור לא יותר מ 10-15 דקות. שים לב לרקמות נמטודות מתחילות להתפורר תוך הביצים (שהם עמידים לפתרון axenizing) נותרו על כנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לשבש גוף נשי כדי לזרז את התהליך, על ידי חיתוכם עם מחט או אזמל (איור 4 ב, ג). הסר ביצים על ידי pipetting אותם לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge, הימנעות הוספת כל רקמה שלא נמסה. הערה: שימוש כמ &#39;כל צינורות microcentrifuge ככל שיידרשו כדי לאסוף ביצים ולעבוד במהירות, כפי שהכדאיות של הביצים תקטן על פני תקופה ממושכת של חשיפה לפתרון axenizing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות וורטקס ל15 שניות באמצעות &quot;הגדרת מהירות גבוהה&quot; כדי להסיר עוד נמטודות רקמות מחוברת לביצים. לחלופין, אם מערבולת אינה זמינה, pipet למעלה ולמטה כמה פעמים הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים גלולה על ידי צנטריפוגה בכ 18,000 גרם במשך 2 דקות. להגדיל את המהירות אם ביצים לא מספיק גלולה. הסר פתרון axenizing ולשטוף פעמיים על ידי מילוי צינור microcentrifuge עם מים מזוקקים סטריליים ו צנטריפוגות עוד פעם אחת ב900 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, resuspend ביצים ב300-500 μl של מים מזוקקים סטריליים ולמקם אותם בצלחת סטרילית 3 סנטימטר פטרי או כוס שעון מעוקרת. זכור כי ביצים נמצאות כעת מעוקר משטח, כך שיש להשתמש טפטפות סטרילי ו / או טיפים pippetter ומים כדי לשמור על ניקיון של הביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לבחון ביצים תחת מיקרוסקופ לנתח (הגדלה 30-50X) כדי לאשר שהם שלמים (איור 4D) ולהעביר אותם לצלחת 5 סנטימטר עם אגר כבד כליות (ראה סעיף 2.1) הערה: אל תוסיף יותר מ -400 μl של ההשעיה הביצה על הצלחות כמו זה יגרום אגר מוגזם רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תווית עם מידע מתאים ולאחסן אותם זקופה בחושך ב28 ° C. בקיעה של ביצים צריכה להיות הלילה מאליו. הערה: מים עשויים להתעבות על המכסה של הצלחת אבל זה יתאדה לאחר 1 או 2 ימים. בשלב זה, למקם את הצלחת בשקית ניילון כדי לשמור על לחות של אגר ולהימנע מהייבוש שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב מנות מעת לעת ולבטל את כל מנות שמראות סימנים של פטרייה או זיהום חיידקים. ברגע שIJS נראה נודדים במעלה הקיר של צלחת פטרי, להסיר את המכסה ולהעביר את צלחת תחתית עם אגר למלכודת לבנה הותאם 12. שקול תנאים סטריליים בעת העברת המנה לmodifieמלכודת לבנה ד כדי למנוע זיהום של התקשורת החשופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ניטור הלבן המלכודות וIJ קציר בהתאם לצורך. הערה: נמטודות Aposymbiotic תמשיך לנדוד לתוך המים הלבנים המלכודת במשך ימים רבים ואפילו שבועות. </li></ol>

<ol>
	<li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.,+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes,+Neoaplectana+and+Heterorhabditis.">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li><li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis.">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li><li>Boemare, N., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology,+taxonomy+and+systematics+of+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> The Prokaryotes. , 473-488 (2002).</li><li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+(Diptera)+and+Galleria+mellonella+(Lepidoptera).">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).</li><li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+insect+nematology.">Techniques in insect nematology.</a> Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Koppenh&#246;fer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Symbionts+of+Steinernema+and+Heterorhabditis.">Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis.</a> Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).</li><li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp.">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li><li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae,+Heterorhabditidae).">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+(Steinernematidae:+Nematoda).">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li><li>Poinar, G. O., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+(Achromobacteriaceae:+Eubacteriales)+associated+with+a+nematode.">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li><li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pag&#232;s, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Breh&#233;li, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila,+its+nematode+vector,+and+insect+hosts.">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li><li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pag&#232;s, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+(Steinernema)+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+(Xenorhabdus).">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li><li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host,+Steinernema+carpocapsae.">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li><li>Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+parasites,+pathogens+and+associated+of+insects+and+invertebrates+of+economic+importance.">Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריזו.

שימוש מארח מתאים הוא גורם מפתח להצלחה בגידול vivo של EPN. בדרך כלל, שתי steinernematids וheterorhabditids יכולים להתרבות ולהשלים בהצלחה מחזור החיים שלהם בזחלים של עש הדונג הגדול יותר, mellonella Galleria (פרפרים: Pyralidae). עם זאת, מיני חרקים אחרים ממשפחות ו / או צווים שונים יכולים להיחשב. כמה ממיני נמטודות תיארו כיום ידועים יש ספציפי למארח חרקים מסוים. לדוגמא, ס &#39; kushidai וס scarabaei אינו מאוד ארסי לזחלי lepidopteran, וצריך זחלים קשים כנפיים כגון זחלי חיפושית חרפושית (Scarabaeidae) לגידול מוצלח במעבדה. מין אחר, S. scapterisci, מעדיף חרקים orthopteran כגון צרצרים או צרצרי שומה. כאשר מארח מתאים אינו זמין, או כאשר תנאי ניסוי דורשים את זה, יכול להיות מועסק במבחנה שיטות לגידול של EPנ &#39;שיטות אלו משתמשות במדיה המציעים מקור עשיר של חומרים מזינים לנמטודות והסימביוזה עם החיידקים שלהם. במצגת זו שתארנו שני סוגים של אגר (כבד כליות ושומנים בדם) שיכול להיות מנוצל לצמיחה המוצלחת ורבייה של EPN עם או בלי החיידקים סימביוטיים שלהם. משתמשים צריכים להיות מודעים לכך שאגרה כבד הכליות היא מדיה עשירה, ולכן הוא מזדהם בקלות. טכניקה סטרילית מומלצת בטיפול בשני ביצי axenized והצלחות המחוסנות במהלך כל השלבים של ההליך. צלחות כי הם מזוהמים בחיידקים או פטרייה צריכה להיות מושלכות באופן מיידי. כאשר גידול aposymbiotic Steinernema IJS, יש להקפיד לlyse כראוי רקמות נמטודות הנשיות, כפי שהם עשויים להכיל חיידקי Xenorhabdus. כמו כן, כדי לאמת שIJ אמנם נקי מחיידקים סימביוטיים, אנו ממליצים שחיקה של מדגם של IJS הטרי שנקטפו בLB עם מוטו שנערך בידr-מונע העלי לפי (Heungens et al. 2002) 7 וצלחת ההשעיה על גבי מדיה NBTA 1. אם מושבות חיידקים נמצאות (לאחר דגירה הלילה) זה יהיה גם אינדיקציה לטכניקת axenization עניה או התוצאה של זיהום. הגידול של נמטודות Steinernema aposymbiotic הוא טכניקה שיכולה להיחשב גם במגוון רחב של נהלים וניסויים. קוראים צריכים להיות מודעים לכך שההשפעה של נמטודות Steinernema גידול ללא סימביוזה עם במשך דורות רבים עשויה להיות השפעה על כושר נמטודות והישרדות על פני פעמים דור. כמה מחקרים מראים שיש הצורך בזיווג שלהם במערכות טבעיות 5,11,15-17. עם זאת, מחקרים אלו נעשו על מספר מצומצם של מינים ויש צורך בחקירה נוספת.

נמטודות Entomopathogenic (EPN) Steinernema וspp Heterorhabditis. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) והסימביוזה עם החיידקים שלהם, Xenorhabdus וspp Photorhabdus (Enterobacteriaceae) נחשבים מודל מתהווה של יחסים סימביוטיים בעלי חי חיידק יבשתי 2-4,6,10,19. Xenorhabdus וspp Photorhabdus. הם טיפחו כבסימביוזה במעיו של שלב חיים נטולי רק של נמטודות, הידוע גם בנוער המזהם (IJ) או שלב 3 rd מזהם נוער 8,10,13. זוג החיידק-נמטודות הוא פתוגניים למגוון רחב של חרקים והצלחה יושם בהדברה ביולוגית ותוכניות טיפול משולבים במזיקים בעולם 6,8. במסמך זה אנו מציגים מבחר של in vivo ו במבחנת טכניקות שלעתים קרובות למימוש לגידול של EPN בתנאי מעבדה. אניn שיטות vivo להרהר מארח חרק לגידול של נמטודות. בדרך כלל, בשלבי בוסר של הזמנות חרקים שונות (כלומר פרפרים, Coleoptera, Diptera, וכו &#39;.) נחשבים מארחים מתאימים. בvivo שיטות נחשבות בדרך כלל לתחזוקה של תרבויות נמטודות במעבדה. שיטה זו עשויה שלא להיות מתאימה כאשר בוחנים ייצור המוני של נמטודות. כמויות גדולות של מארחי חרקים עשויות להידרש לעניין זה דורש יותר זמן ועלויות נוספות הקשורות לגידול החרקים. יכולה גם להיות מתורבת נמטודות Entomopathogenic במבחנה בכמה כלי תקשורת. בהתאם למטרת המחקר, בשיטות מבחנה עשויה או לשקול ההתאגדות של החיידקים סימביוטיים בתקשורת. במצגת זו, אנו מתארים שתי שיטות נפוצות להפצת EPN. מרכיביה של התקשורת לספק מקור של חומרים מזינים לחיידק סימביוטיבמבחנה שיטות nd מקור סטרולים לנמטודות. מציעות את היתרון הגידול של EPN ללא מארח חרק. במקור, רבים מכלי התקשורת במבחנה פיתחו שמשו לכפל של EPN כאשר מארחי חרקים מתאימים אינם זמינים. עם זאת, במהלך השנים האחרונות, במבחנה שיטות גידול הפכו עובדים רבים במחקר שמטרתו להבין את הקשר בין mutualistic EPN והחיידקים סימביוטיים 17,19. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה&quot;ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">For &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; Infections</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>Grade 1 filter paper recommended</td></tr><tr><td>Insect hosts</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>&lt;em&gt;Galleria mellonella&lt;/em&gt; are recommended</td></tr><tr><td colspan="4">For Liver-kidney Agar (for 500 ml)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Beef liver, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Beef kidney, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>any research grade NaCl can be used</td></tr><tr><td>Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>500 ml distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">For Lipid Agar (for 1 L)</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient broth, 8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract, 5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>Corn oil, 4 ml</td><td>Any brand</td><td>Locally source; supermarket</td><td>Any brand of corn oil can be used</td></tr><tr><td>Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and swirl for homogeneity</td><td>Karo</td><td>Locally sourced; supermarket</td><td></td></tr><tr><td>Agar, 15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

נמטודות Entomopathogenic (EPN) (Steinernematidae וHeterorhabditidae) יש שותפות mutualistic עם Gamma-Proteobacteria גראם שלילי במשפחת חיידקי Enterobacteriaceae. Xenorhabdus קשורים לנמטודות steinernematids בעוד Photorhabdus היא סימביוזה של heterorhabditids. יחד נמטודות וחיידקים יוצרים מורכבת קוטלי חרקים חזקים שהורג מגוון רחב של מיני חרקים בשותפות אינטימית וספציפית. במסמך זה, אנו מדגימים in vivo ובטכניקות מבחנה בשימוש נפוץ בגידול של נמטודות אלה בתנאי מעבדה. יתר על כן, טכניקות אלה מייצגים שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN וגם יוצרות את הבסיס לbioassays האחר שעושים שימוש באורגניזמים אלה למחקר. הייצור של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט) הוא לעתים קרובות קריטי לעומק ובגישה רבת פנים למחקר של סימביוזה. זהפרוטוקול אינו דורש תוספת של אנטיביוטיקה וניתן להשיג בפרק זמן קצר עם ציוד מעבדה סטנדרטי. נמטודות מיוצרות באופן זה הן חזקות יחסית, אם כי השארות שלהם באחסון עשויות להשתנות בהתאם למין משמש. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה של פ המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה&quot;ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.

שיטת גידול in vivo משתמשת חרקים חיים כמארחים לצמיחת נמטודות ורבייה. תאי דלקת הם שיטה יעילה לחשיפת IJS חרקים. זהו השלב היחיד במעגל החיים &#39;נמטודות שוקטורים בסימביוזת החיידקים ממארח ​​חרק אחד למשנהו. איור 1 מציג את להגדיר עבור תא זיהום, כמו גם את החומרים הדרושים לבניית תא זה. במבחנה שיטות גידול לאפשר EPN לגדול בלי מארח חרק, אלא גם מיושמים לגידול של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט). איור 2 מראה צלחת אגר שומנים עם שלבי נמטודות שונים. צלחות אגר שומנים גם יכולות להיחשב בבדיקות הכלאה צולבת אשר נדרשות כדי לאמת את זהות נמטודות מבוססת על רעיון המינים הביולוגי. השיטה אגר כליות כבד תוארה במקור על ידי Poinar &amp; Thomas (1966) 14. שיטה זו מאפשרת נמטודות להתבגר ורפרודוקציהדואר ללא מארח חרק והוא יכול לשמש לנמטודות האחורית ללא חיידקים סימביוטיים שלהם (כלומר לייצר נמטודות aposymbiotic). חסרון של שיטה זו היא שהיא נוטה לזיהום בגלל האופי העשיר שלהם, המאפשר חיידקים או פטריות לא רצויים לגדול. איור 3 א מציג צלחות אגר כבד כליות עם IJS זוחל על הצד השני של הצלחת. בשלב זה החלק התחתון של צלחת פטרי ניתן להעביר למלכודת לבנה שונה. איור 3 מדגים צלחת כבד כליות עם נמטודות Steinernema במלכודת לבנה הותאם לאסיף צאצאי IJS. איור 4 א תערוכות זכוכית שעון עם הרה להולדת נקבות Steinernema לפני axenization. איור 4 מציגה את השיבוש של הנקבות עם איזמל מנתחים. איור 4C תערוכות שיבש נקבות בפתרון axenizing. איור 4D תערוכות ביצה שלמה של נמטודות Steinernemcarpocapsae. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52096/52096fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 להגדיר של תא זיהום לגידול in vivo של EPN. שורה עליונה מציגה נייר 5 סנטימטר צלחת פטרי ומסנן. בשורה התחתונה מציגה נייר צלחת ומסנן 10 סנטימטר פטרי. מספר הודעה של זחלי חרקים, הוסיף לכל תא זיהום. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52096/52096fig2highres.jpg" width="500" /> שיטה אגר 2 שומנים איור לגידול במבחנה של EPN. התמונה מראה תקריב (הגדלה 20X) של צלחת עם נמטודות בוגרות מתפתחות במדיום. <img alt="איור 3" fo:content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,096 / 52096fig3highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; איור 3 כבד כליה אגר צלחת. תמונה משמאל ניתן לראות צלחת עם צמיחה מוצלחת של נמטודות. שים לב נמטודות זוחלת על הצד השני של הצלחת. תמונה ב &#39;מראה צלחת אגר כבד כליות ממוקמת במלכודת לבנה הותאם לאסיף נמטודות IJ. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52096/52096fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 כוס Watch עם נקבות הרות להולדת בaxenizing פתרון. תמונה מראה נשים הרות להולדת בפתרון axenizing. תמונה ב &#39;מראה שחיקה של הנקבות עם מחט לנתח. מציג C התמונה שיבש נקבות. התמונה D תערוכות ביצה שלמה של carpocapsae Steinernema נמטודות.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae at JoVE.com

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.5K Views.  University of Arizona.  המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה. 

Video: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Environment

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetics

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Immunology and Infection

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

בידוד מהיר של נמטודות פראיות על ידי משפך ברמן

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Biology

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

<meta charset="utf8"></head><body>אופטימיזציה של זיהום נמטודות עץ אורן ב Pinus pinaster

Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles

The pinewood nematode (PWN) is a phytoparasite that causes pine wilt disease (PWD) in conifer species. This plant parasitic nematode has heavily contributed to pine deforestation in Asian countries, e.g., Japan, China, and Korea. Over the last two decades, in Europe, Portugal and Spain have been greatly affected. Research on the mechanisms of PWN infection and/or PWD progression in susceptible host species relies on the controlled infection of pine seedlings under greenhouse conditions. This technique is laborious and mobilizes substantial economic and human resources. Additionally, it can be prone to variability that results from the genetic diversity associated with some pine species but also from the interference of external factors. As an alternative, in vitro co-cultures of pine with PWNs offer a more advantageous system for studying biochemical changes since they a) allow controlling single environmental or nutritional variables, b) occupy less space, c) require less time to obtain, and d) are&#160;free from contamination or from host genetic variation. The following protocol details the standard in vivo PWN infection of Pinus pinaster, the maritime pine, and the establishment of the novel in vitro co-cultures of pine shoots with the PWN as an improved methodology to study this phytoparasite influence on pine volatiles. PWN-induced volatiles are extracted from in vivo and in vitro infected pines by hydrodistillation and distillation-extraction, and the emitted volatiles are captured by solid phase microextraction (SPME), using fiber or packed column techniques.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: מערכת תרבות משותפת במבחנה של יורי אורן ונמטודה של עץ אורן לחקר תגובה נדיפה של מארח

The protocol describes the in vivo and in vitro pinewood nematode infection of Pinus pinaster and their volatilome analysis through Gas Chromatography (GC) and GC coupled to Mass Spectrometry (GC-MS).

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video