This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).

הערה: לפני מתן דגימות רוק כל הנושאים נתנו הסכמה מדעת התואמת את הקווים המנחים לטיפול בבני אדם בבית החולים לילדים בפריסה ארצית. .1 רוק איסוף ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני אוסף רוק, להבטיח כי הפה של הנושא הוא ללא מזון או חומרים זרים אחרים על ידי בעל העניין לשטוף את פיהם במים והימנעות אכילה או שתייה במשך 30 דקות לפני איסוף הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל עם 2.5 מ&quot;ל של חיץ ייצוב DNA 2 והקפד להימנע מלגעת בחלק הפנימי של הכובע או צינור, ויש לי את הנושא לירוק 2.5 מ&quot;ל של רוק לפתרון החיץ. שים לב: איסוף יותר מ 2.5 מ&quot;ל של רוק יכול להוביל להשפלת מדגם מיחס מספק של מדגם לחיץ ייצוב DNA. איסוף רוק מעט מדי יפחית תשואות הצפויות מהפרוטוקול. כדי להעריך את היקפי גבייה, להשתמש במעברי הצבע הממוספרים בצד של tהוא הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף כובע ומערבבים על ידי היפוך עד לקבלת התערובת הומוגני. טלטול נמרץ הוא לא הכרחי. אחסן את הדגימות ב RT עבור אחסון לטווח קצר או 4 ° C לאחסון לטווח ארוך (&gt; 3 חודשים). </li></ol> 2 הכנות ראשוניות ותמוגה תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת ההפקה, לחמם אמבט מים ל37 מעלות צלזיוס, ולהכין דלי קרח. שלושה 15 צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות חרוטי יהיה צורך עבור כל דגימה שחולצה. שלושה צינורות ישמשו כדי להחזיק את התא גלולה וחלבון, gDNA חילוץ הסופי, וsupernatants isopropanol ואתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דוגמאות קרקע מאחסון, ודגימות הפכו כמה פעמים ואז מערבולת במהירות בינונית במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 2.5 מ&quot;ל של מדגם לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ&quot;ל, ולהוסיף 5 מ&quot;ל של תא תמוגה פתרון. מערבבים את המדגם 50 פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך 30 דקות. </li></ol> הסרת .3 RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של RNase סולution ב100 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם מאמבט המים 37 מעלות צלזיוס ומגניבה על קרח למשך 3 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה RNase, להעלות את הטמפרטורה של המים באמבטיה ל65 מעלות צלזיוס למשך הצעד להחזרת נוזלי DNA של הפרוטוקול. </li></ol></li></ol> .4 חלבון והסרת שומנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של proteinase K פתרון ב20 מ&quot;ג / מ&quot;ל, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות. הערה: זוהי נקודת השהיה אפשרית לפרוטוקול. לאחר התוספת של proteinase K הפתרון, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד ליכול להסתיים החילוץ. האחסון בC ° 4 עד 24 שעה לא הוצג להיות השפעה משמעותית על תשואות מיצוי או איכות DNA. אחסון לטווח ארוך, בשלב זה לא נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.7 מ&quot;ל של פתרון משקעים חלבון, מערבולת במרץ ל20 שניות במהירות גבוהה, ומניחים על קרח עבור 10 דקות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגימות התקררו על קרח עבור 10 דקות, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 3,000 XG ו4 מעלות צלזיוס. החלבונים זירז חייבים ליצור גלולה חזקה להמשיך. אם גלולה היא לא חזקה או הפתרון הוא עדיין מעונן, יכולות להיות מקוררות על דגימות קרח למשך 5 דקות נוספות וצנטריפוגה חוזרת ונשנית. הדגימות חייבות להיות כל הזמן על קרח כדי להבטיח גלולה הדוקה. </li></ol> .5 בידוד וטיהור של gDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ&quot;ל, pipet 5 מ&quot;ל של אלכוהול איזופרופיל ו8 μl של טהור גליקוגן פתרון ב20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant המכיל gDNA משלב 4.3 לתוך הצינור המכיל האלכוהול איזופרופיל וגליקוגן פתרון, והותיר אחריו את כדור החלבון זירז. ברגע שsupernatant נוסף, לערבב בעדינות המדגם 50 פעמים על ידי היפוך וצנטריפוגות במשך 30 דקות ב 3,000 XG ו4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant לאט לתוך צינור 15 מ&quot;ל נקי. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 1 מ&quot;ל של אתנול 70% ללשטוף את הכדור על ידי נדנדה לאט ובעדינות נעו אתנול על גלולה זירז כמה פעמים. שמור אתנול בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הראשונית, צנטריפוגות המדגם 1 דקות ב2,000 XG ו20 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות צעד צנטריפוגה זה ברמת 4 מעלות צלזיוס או 20 מעלות צלזיוס. אין השפעה משמעותית של טמפרטורה הוכחה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בעקבות לשטוף וצנטריפוגה הראשוניות של גלולה לשפוך לאט לשטוף אתנול מהצינור וזורקים, ולאחר מכן לבצע לשטוף את השני על ידי חזרה על שלבי 5.3 ו5.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant מלשטוף את השני, לאפשר את גלולה לייבוש באוויר במשך 15 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם לא התייבש לחלוטין, אוויר יבש לעוד דקות 15. </li></ol></li></ol> .6 Rehydration של gDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם התייבש, להוסיף 300 μl של טריס-EDTA לרעננות גלולה gDNA המיובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת המדגם במשך 5 שניות במהירות בינונית ומניחים באמבט מים חמים 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימות מאמבט המים ודגירת O / N ב RT. הערה: כל מוצרים וחומרים כימיים המשמשים מפורטים בלוח חומרים, כמו גם לוח 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies.">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li><li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes.">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li><li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy.">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 6, 444-446 (2005).</li><li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet.">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li><li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+blood,+saliva,+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort:+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA.">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li><li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva:+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc&#947;+receptor+iia+(cd32)+and+fc&#947;+receptor+iiib+(cd16).">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fc&#947; receptor iia (cd32) and fc&#947; receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li><li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates,+from+salivary+analyses,+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth.">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li><li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale,+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies.">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array:+A+comparison.">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).</li><li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+genotype-phenotype+model+determinism:+Application+to+bivariate+reading/language+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families.">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li><li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+precipitation+of+DNA.">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data.">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם סקר כאן, חוץ מאחד שלא הופץ באופן נרחב 11. לא חל שינויים באיכות DNA הקשורים לצנטריפוגה עוד זה התגלו, המצביע על כך שרוב DNA הזמינים מאוסף רוק שלם הוא לא מושפל וגבוה משקל מולקולרי. יש אוסף רוק כל מגבלות באיכות דגימה כגון פוטנציאל למזהמים זרים, אשר צריך להיות ממוזערים בשלב האיסוף, ואת הנוכחות של חלבון מוגזם במדגם שיכול להיות סימן לזיהום בסיסי. כמויות גדולות של מזהמי חלבון או זר יכוליישאר בDNA שחולץ הסופי ובכך מה שהופך את הכימות מדויק. אם יש חלבונים או מזהמים הנותרת לאחר החזרת נוזלים (שלב 6) חשודים, מדגם לנקות יכול להתבצע על ידי החל משעת צעד הממטרים חלבון עם נפחים מגיב בקנה מידה על מנת לשקף את קלט נפח דגימה. מגבלה נוספת של הפרוטוקול היא את משך הזמן שנדרש כדי לבצע את הצעדים. דוגמאות רבות ניתן להפעיל במקביל; עם זאת, מומלץ שלא יותר מ 24 עקירות מקבילות שיופעלו בו זמנית. הדבר חשוב במיוחד לצעד הממטרים חלבון, שבו המדגם חייב להישאר קר כדי להבטיח גלולה הדוקה ופועלים יותר מ -24 דגימות עשויים לאפשר זמן כדורים מחדש להתמוסס. הפרוטוקול המובא כאן הוא שיטת העלות האפקטיבית ביותר נחשבת (ראה טבלה 3). בעוד פרוטוקול זה עושה שימוש ריאגנטים מערכת חילוץ Puregene, נפח קטן יותר ממומלץ בפרוטוקול Puregene משמשמבלי להתפשר על תשואת מיצוי וזה הפחתה זו בחומרים כימיים שמניע את החיסכון בעלויות בהשוואה לפרוטוקול. שים לב שהעלות המחושבת להפקה משתמשת במחיר המחירון לכל פריט ואינו משקפת שום הנחות. העלות לחילוץ עם הפרוטוקול מותאם ניתן להפחית עוד יותר עם הזמנות בכמויות גדולות או הנחות באמצעות נציגי מכירות של חברה. ראיות גם כבר ובלבד שפרוטוקול זה הוא מתאים לשימוש עם הרצף של הדור הבא. הנתונים שהתקבלו מספק ראיות נוספות לשימושיות של דגימות רוק למחקר גנטיקה של אדם במחלות רבות שבם דם אינו זמין באופן שיגרתי. בעוד DNA נגזר קו דם והתאים ממשיך להיות המקור המועדף של חומר גנטי לבדיקה, אוסף רוק שלם היא חלופה מעשית כאשר מקורות אלה אינם זמינים, כאשר גיוס חולה מושפע מהאוסף או לקיחת דמם אינו זמין ואין זה מעשי.

קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק 1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות 2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות של מתן דגימת רוק במקום דם 3, 4. חששות לגבי הכמות והאיכות של DNA מרוק יכולים להיות המוגבלים הנרחבדואר למרות מחקרים שנעשה לאחרונה מחקרים רבים המראים את התאמתו של כל רוק, עם ממוצע של 4.3 x 10 5 תאים למיליליטר, לבדיקות DNA על פני שיטות מטליות buccal המבוגרות שלא לקבל כמויות משמעותיות של רוק 2, 3, 4, 5, 6. בעוד ספרות צנועה קיימת מראה את ההתאמה של DNA רוק השלם נגזר עבור יישומי גנוטיפ כולל שיטות המבוסס על microarray 8, 9, רצף 10, אין מחקרים בחנו הדור הבא (NGS). המטרה לייעול פרוטוקול חילוץ זה כל DNA הרוק הייתה למקסם את הכמות ואיכות עבור יישומי גנטיקה בדרך יעילה עלות שמיושמת בקלות במעבדות עם חומרים כימיים וחומרים נפוצים. מיצוי DNA מרוק דורש מספר הליכים: 1) איסוף ואחסון, טיפול RNase 2) תמוגה תא, 3), 4) ממטרים חלבון, 5) משקעים אתנול, 6) להחזרת נוזלי DNA. פתרון DNA ייצוב הצפת, שתוארבעבר 2, פונקציות כראוי ללא שינוי. שום ניסיון לייעל את טיפול RNase וצעדים להחזרת נוזלי DNA נעשה. לכל שלב שנותר, מספר משתנה שיכול להשפיע על תשואה זוהו. כל אחד ממשתנים היו מניפולציות באופן אישי ושיפור בתפוקה ואיכות הוערך סטטיסטי. עבור משתנים שהוצגו כדי לשפר את התשואה ו / או איכות DNA, הערכים אופטימליים נכללו בפרוטוקול הסופי.

<table><tbody><tr><td>15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lysis Solution</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Protein Precipitation Solution</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M) Solution</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analog Vortex Mixer</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and extraction of saliva dna for next generation sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים להפקה DNA סדרה של עקירות DNA מזווגות בוצעה. דגימת רוק אחת פוצלה וכל מנה שנבדקה עם אחד משני ערכים אפשריים עבור משתנה נתון. לפחות שמונה חזרות של כל בדיקה לזווג בוצעו (למשל, דגימת רוק אחת הייתה aliquoted לבדוק חילוץ עם או בלי הדגירה C ° 50 ראשונית). אופטימיזציה הייתה מבוססת על ארבעה מדדים סטנדרטיים: תשואה כוללת DNA, ערך 260/280, ערך 260/230, ובדיקה ויזואלית של DNA electrophoresed להעריך פיצול. לא כל הצירופים האפשריים של המשתנים הוערכו אינטראקציות סטטיסטיות (N = 169 שילובים), ובמקום זאת בוחר להעריך את ההשפעה השולית של כל משתנה בנפרד. השפעות נבדקו באמצעות רבת דרך ANOVA החוזרים ונשנים-צעדים ואפקטים משוערים נגזרו ממשוואת הרגרסיה שוות ערך. כל ההשפעות משמעותיות מסוכמות בטבלה 1, מוצגים כאברבךשינוי גיל בתשואה (ng / μl לכל מ&quot;ל של קלט רוק) או איכות DNA (260/280 ו260/230). תמוגה תא (שלב 2) הייתה מותאמת על ידי הערכה: 1) הנוכחות / היעדרות של דגירה C ° 50 (1 שעות) לפני תא תמוגה כדי להבטיח ששפלת proteinase K ותמוגה תא בתיווכו של מאגר האחסון הלכו להשלמה, 2 נוכחות) / היעדר המגון ידי vortexing צעד (מהירות בינונית, 15 שניות), ו3) זמן דגירה פתרון תמוגה (5 לעומת 30 דקות). הדגירה תמוגה תא 30 דקות עלתה תשואה בשיעור ממוצע של .3.5% (p &lt;.01) אבל לא היה לי משתנה תמוגה תא אחר השפעה משמעותית על תשואה. Vortexing ירד היחס 260/280 ידי מובהק סטטיסטי (p &lt;.001) אך קטן 0.03 כמעט. ממטרים חלבון (שלב 4) שקדמו על ידי עיכול proteinase K לשבש שרשרות של חומצות אמינו, לשפר את יעילות ממטרים חלבון ושחרור נתפסו DNA. הסכום של proteinase K היה מגוון של פי עשר.טמפרטורת צנטריפוגה הופחתה מ 20 מעלות צלזיוס עד 4 מעלות צלזיוס. הגדלת כמות proteinase K גרמה לירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית בתשואה (8.7%) והן 260/280 ו260/230 היחסים גם השתפרו מעט. משקעים אתנול (שלב 5) היה השלב האחרון של הפרוטוקול שנבדק. הסכום של מוביל גליקוגן (0, 8 μl) היה מגוון, כפי שהיה בזמן צנטריפוגה סך הכל (5 לעומת 30 דקות 11). רק זמן צנטריפוגה מושפע באופן משמעותי תשואה, עם עלייה ממוצעת של 290%. הספין כבר ירד גם היחס 260/280 מעט (0.05). אין השפעה משמעותית של גליקוגן בתשואה נצפתה במהלך הניסויים; למרות שהכמות הכוללת של DNA בעקירות אלה היו מספיק גדול שגליקוגן לא בדרך כלל לשמש. למרות חוסר ההשפעה בדגימות אלה, הוא עדיין ממליץ להשתמש גליקוגן כדי למזער את הסיכון של תשואות מופחתות בכל פעם שקלט רוק הנפח נמוך מניתן כאן או אם יסדואר הוא מכל סיבה אחרת להאמין תשואה תהיה נמוכה. בדיקה ויזואלית של דגימות DNA נציג (איור 1) הצביעה על כך שDNA שחולץ היה לא מקוטע מאוד לכל הליך מיצוי DNA רוק, אלא הראתה להקת משקל ראויה מולקולרית גבוהה בלי מריחות מעידות על DNA המושפל. לאחר RNase עיכול, הפרוטוקול שהופק 260/280 ממוצע של 1.74. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51697/51697fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 איכות של DNA נגזר רוק. ארבעה נהלי חילוץ יושמו לאותו אוסף הרוק. דוגמאות (א) היו electrophoresed על ג&#39;ל 0.8% agarose (250 DNA ng). כל הווריאציות של פרוטוקולי מיצוי DNA הרוק לגרום למשקל מולקולרי גבוה DNA (&gt; 20 kb), ללא עדות של השפלה. ליין: ladde DNA 1r, 2 ו -3 דגימות Oragene prepIT L2P פרוטוקול, 4 &amp; 5 Gentra Puregene גוף נוזלי פרוטוקול, 6 &amp; 7 הפרוטוקול מותאם ללא צעד הסרת RNA, 8 ו -9 בפרוטוקול מותאם לשלב להסיר RNA. נתיבים 2-7 ישירות פרוטוקולים מקבילים באותו דגימות רוק. נתיבים 8 &amp; 9 מראים כי צעד הסרת RNA לא להציג את השפלת DNA. דוגמאות (ב) electrophoresed על ג&#39;ל 2% agarose (150 DNA ng). שיא RNA קל הוא נצפים קרובים לתחתית של ג&#39;ל בנתיבים 2 עד 7 (אמנות כאמור לעיל). נתיבים 8 &amp; 9 להראות את האפקטיביות של צעד הסרת RNA. שלב הסרת RNA (שלב 3 עם RNase) הוא קריטי עבור כימות מדויק של DNA. במהלך בדיקה, תוכן RNA גבוה באופן עקבי נצפה, כפי שנקבע על ידי היחס של גדילי הדנ&quot;א כפול לרנ&quot;א שנמדד על ידי קיוביט 2.0 fluorometer. על תוכן ממוצע, חומצות גרעין מדגימות ללא RNase טיפול מורכב מ46.6% (± 0.4) RNדוגמאות א &#39;שעברו שלב להסרת RNA לקרוא בשם &quot;&lt;20 ng / ml&quot;, המהווה את הקריאה הנמוכה ביותר האפשרית עבור זיהוי RNA של קיוביט. DNA שהושג באמצעות פרוטוקול מותאם זה היה באיכות מספקת עבור סידור תפוקה גבוהה כאשר RNase נוסף צעד יושם. כדי להשיג נתונים resequencing ממוקדים, ערכת Agilent SureSelect יעד העשרה מותאמת אישית יושמה ל24 דגימות, מיקוד 2.6 Mb של רצף. רצף תפוקה גבוה נערך ביום 12 בדגימות המבורקד (צמודות) לכל נתיב. רצף קורא היו מיושר BWA לגנום התייחסות hg19 12, אז יישום של כיול איכות בסיס GATK 13 ציון, התכנסות indel, ההסרה כפולה, גילוי SNP וgenotyping בו זמנית בכל 24 הדגימות בוצע באמצעות פרמטר סינון קשה להתאמן הכי טוב ערכי 14. כל 24 הדגימות הניבו איכות גבוהה NGS נתונים (טבלה 2). של שקורא עבר Illuמינה של המסננים סטנדרטיים והיה לי Q&gt; 20, 91.4% מיושרים לאזורי יעד העשרת רצף, מתן עומק כיסוי ממוצע על היעד של&gt; 30x כיסוי בQ&gt; 100, גם בתחומים החיוניים לגילוי SNP נדיר בכל דגימה. יתרת הגדיל הממוצעת הייתה 49.9%. שיחות גרסת השוואה עם גנוטיפים microarray Illumina הניבו התאמה של 98.9%. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> משתנה מועמד </td><td> ng / μl </td><td> 260/280 </td><td> 260/230 </td></tr><tr><td> וורטקס </td><td> ns </td><td> -0.03 *** </td><td> ns </td></tr><tr><td> Cell דקות X30 תמוגה דגירה </td><td> 3.5% ** </td><td> ns </td><td> ns </td></tr><tr><td> Proteinase K x10 </td><td> -8.7% * </td><td> -0.05 *** </td><td> -0.03 *** </td></tr><tr><td> ספין 30 דקות </td><td> 290.2%<html> *** </td><td> -0.05 *** </td><td> ns </td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> ns </td><td> ns </td><td> -0.37 *** </td></tr></tbody></table> גודל .1 השפעת טבלה משתנה אופטימליים בכמות מדדים / איכות. כל גדלי ההשפעה הם ביחידות המופיעות בכותרת העמודה. p-ערכים מניתוח שונה: * p &lt;.05; ** P &lt;.01; *** P &lt;.001; NS לא משמעותי <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> איכות מטרי </td><td> ערך </td></tr><tr><td> אורך יעד </td><td> 1,708 kb </td></tr><tr><td> יעד מקורה&gt; 30x </td><td> 85.22% </td></tr><tr><td> SNPs בdbSNP </td><td> 92.55% </td></tr><tr><td> הסכם מערך </td><td> 98.99% </td></tr></tbody></table> לוח 2: איכות של תפוקה גבוהה רצף מהיעד העשרה. <table bo</html style=";text-align:right;direction:rtl">בצו = = = רוחב cellpadding &quot;0&quot; cellspacing &quot;0&quot; &quot;0&quot; = &quot;668&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="14"> פרוטוקול אופטימלי חדש </td><td> פריט </td><td> מפיצים </td><td> # קטלוג </td><td> יחידת רכש </td><td> עלות / יחידה </td><td> עלות / אוסף </td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל צנטריפוגה צינורות </td><td> פישר </td><td> 12-565-268 </td><td> 500 צינורות </td><td> 233.50 $ </td><td> 3.2690 $ </td></tr><tr><td> תא תמוגה פתרון </td><td> Qiagen </td><td> 158,908 </td><td> L 1 </td><td> 401.00 $ </td><td> 3.2080 $ </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma </td><td> P6556 </td><td> 1 גרם </td><td> 713.00 $ </td><td> 1.5686 $ </td></tr><tr><td> פתרון רטיבות חלבון </td><td> Qiagen </td><td> 158,912 </td><td> 350 מ&quot;ל </td><td> 350.00 $ </td><td> 2.7200 $ </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> פישר </td><td> A416-4 </td><td> מקרה של 4 x 4 L </td><td> 486.71 $ </td><td> .2434 $ </td></tr><tr><td> גליקוגן פתרון (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> EZ-BioResearch </td><td> S1003 </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 51.00 $ </td><td> .8160 $ </td></tr><tr><td> אתנול 70% </td><td> פישר </td><td> 04-355-305 </td><td> מקרה של 4 x 1 גל. </td><td> 123.03 $ </td><td> .0325 $ </td></tr><tr><td> טריס-EDTA (TE) </td><td> פישר </td><td> BP2473-1 </td><td> L 1 </td><td> 68.67 $ </td><td> 0.0412 $ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> פישר </td><td> AC194090010 </td><td> 1 קילוגרם </td><td> 34.65 $ </td><td> 0.000004 $ </td></tr><tr><td> טריס HCl </td><td> פישר </td><td> BP1757-100 </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 57.84 $ </td><td> .0116 $ </td></tr><tr><td> EDTA פתרון (0.5 M) </td><td> פישר </td><td> 03-500-506 </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 33.60 $ </td><td> .0134 $ </td></tr><tr><td> נתרן Dodecyl סולפט </td><td> פישר </td><td> BP166-100 </td><td> 100 גרם </td><td> 59.95 $ </td><td> .0060 $ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> עלות כוללת </td><td> 11.93 $ </td></tr><tr><td rowspan="8"> Oragene </td><td> פריט </td><td> מפיצים </td><td> # קטלוג </td><td> יחידת רכש </td><td> עלות / יחידה </td><td> עלות / אוסף </td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל צנטריפוגה צינורות </td><td> פישר </td><td> 12-565-268 </td><td> 500 צינורות </td><td> 233.50 $ </td><td> 0.9340 $ </td></tr><tr><td> אתנול 100% </td><td> פישר </td><td> BP2818-100 </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 34.29 $ </td><td> 1.6459 $ </td></tr><tr><td> אתנול 70% </td><td> פישר </td><td> 04-355-305 </td><td> מקרה של 4 x 1 גל. </td><td> 123.03 $ </td><td> 0.0081 $ </td></tr><tr><td> טריס-EDTA (TE) </td><td> פישר </td><td> BP2473-1 </td><td> L 1 </td><td> 68.67 $ </td><td> .0687 $ </td></tr><tr><td> צינור 1.5 מ&quot;ל </td><td> Genesee </td><td> 22-281A </td><td> 500 צינורות </td><td> 22.85 $ </td><td> 0.0457 $ </td></tr><tr><td> KIT Oragene האוסף </td><td> Oragene </td><td> OG-500 </td><td> 1 </td><td> 25.00 $ </td><td> 25.00 $ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> עלות כוללת </td><td> 27.70 $ </td></tr><tr><td rowspan="14"> Puregene </td><td> פריט </td><td> מפיצים </td><td> # קטלוג </td><td> יחידת רכש </td><td> עלות / יחידה </td><td> עלות / אוסף </td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל צנטריפוגה צינורות </td><td> פישר </td><td> 12-565-268 </td><td> 500 צינורות </td&gt; <td> 233.50 $ </td><td> 0.9340 $ </td></tr><tr><td> תא תמוגה פתרון </td><td> Qiagen </td><td> 158,908 </td><td> L 1 </td><td> 401.00 $ </td><td> 4.0100 $ </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158,918 </td><td> 650 מ&quot;ל </td><td> 73.10 $ </td><td> 7.8723 $ </td></tr><tr><td> פתרון רטיבות חלבון </td><td> Qiagen </td><td> 158,912 </td><td> 350 מ&quot;ל </td><td> 350.00 $ </td><td> 4.0000 $ </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> פישר </td><td> A4164 </td><td> מקרה של 4 x 4 L </td><td> 486.71 $ </td><td> .3650 $ </td></tr><tr><td> גליקוגן פתרון </td><td> Qiagen </td><td> 158,930 </td><td> 500 מ&quot;ל </td><td> 64.30 $ </td><td> 2.5720 $ </td></tr><tr><td> אתנול 70% </td><td> פישר </td><td> 04-355-305 </td><td> מקרה של 4 x 1 גל. </td><td> 123.03 $ </td><td> 0.0975 $ </td></tr><tr><td> DNA הידרציה פתרון </td><td> Qiagen </td><td> 158,914 </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 69.80 $ </td><td> 0.1396 $ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> פישר </td><td> AC19409-0010 </td><td> 1 קילוגרם </td><td> 34.65 $ </td><td> 0.000004 $ </td></tr><tr><td> טריס HCl </td><td> פישר </td><td> BP1757-100 </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 57.84 $ </td><td> .0116 $ </td></tr><tr><td> EDTA פתרון (0.5 M) </td><td> פישר </td><td> 03-500-506 </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 33.60 $ </td><td> .0134 $ </td></tr><tr><td> נתרן Dodecyl סולפט </td><td> פישר </td><td> BP166-100 </td><td> 100 גרם </td><td> 59.95 $ </td><td> .0060 $ </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td> עלות כוללת </td><td> 19.99 $ </td></tr></tbody></table> לוח 3: השוואת עלות של הפרוטוקול מותאם כדי לחלץ דנ&quot;א מ2 מ&quot;ל של כל רוק עם פרוטוקולים זמינים מסחרי אחרים.ריאגנטים ll ומתכלים הנדרשים למיצוי DNA כבר הוערכו באמצעות רשימת מחירים סטנדרטיים זמינים באינטרנט החל מיום 30 בספטמבר 2013. הערה שפרוטוקול זה נכתב כדי לחלץ דנ&quot;א מ1.25 מ&quot;ל של כל רוק (כלומר, 2.5 מ&quot;ל של רוק וחיץ , ראה שלב 2.3) כערך זה מייצג מחצית מהנפח הכולל בצינור איסוף רוק. להשוואת העלות, 2 מ&quot;ל נבחר כזה הוא הסכום הקשורים לערכה נפוצה זמינה מסחרי (Oragene). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="264" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> DNA ייצוב חוצץ (250 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> רכיב </td><td> נפח (מ&quot;ל) </td><td> [סופי] </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> 1.461 גרם </td><td> 0.1 M </td></tr><tr><td> טריס HCl </td><td> 2.5 </td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td> EDTA 0.5M </td><td> 5 </td><td> 0.01 M </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 12.5 &lt;/ Td&gt; <td> 0.014 M </td></tr><tr><td> Proteinase K פתרון (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> 2.5 </td><td> 6.92x10 -6 M </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 227.5 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Proteinase K פתרון (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> רכיב </td><td> נפח (מ&quot;ל) </td><td> [סופי] </td></tr><tr><td> אבקת proteinase K </td><td> 500 מ&quot;ג </td><td> 6.92x10 -4 M </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 25 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> אתנול 70% (500 מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> רכיב </td><td> נפח (מ&quot;ל) </td><td> [סופי] </td></tr><tr><td> אתנול 95% </td><td> 368.5 </td><td> 12.63 M </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 131.5 </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 4 מתכונים לריאגנטים.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing at JoVE.com

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

collection-and-extraction-of-saliva-dna-for-next-generation-sequencing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

39.1K Views.  The Research Institute at Nationwide Children's Hospital. DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Video: Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genetics

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Environment

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Cancer Research

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification of indigenous peptidome of human saliva without prior digestion with exogenous enzymes becomes imperative, since native peptides in human saliva provide potential values for diagnosing disease, predicting disease progression, and monitoring therapeutic efficacy. Appropriate sampling is a critical step for enhancement of identification of human indigenous saliva peptidome. Traditional methods of sampling human saliva involving centrifugation to remove debris 3-4 may be too time-consuming to be applicable for clinical use. Furthermore, debris removal by centrifugation may be unable to clean most of the infected pathogens and remove the high abundance proteins that often hinder the identification of low abundance peptidome.
Conventional proteomic approaches that primarily utilize two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) gels in conjugation with in-gel digestion are capable of identifying many saliva proteins 5-6. However, this approach is generally not sufficiently sensitive to detect low abundance peptides/proteins. Liquid chromatography-Mass spectrometry (LC-MS) based proteomics is an alternative that can identify proteins without prior 2-DE separation. Although this approach provides higher sensitivity, it generally needs prior sample pre-fractionation 7 and pre-digestion with trypsin, which makes it difficult for clinical use. 
To circumvent the hindrance in mass spectrometry due to sample preparation, we have developed a technique called capillary ultrafiltration (CUF) probes 8-11. Data from our laboratory demonstrated that the CUF probes are capable of capturing proteins in vivo from various microenvironments in animals in a dynamic and minimally invasive manner 8-11. No centrifugation is needed since a negative pressure is created by simply syringe withdrawing during sample collection. The CUF probes combined with LC-MS have successfully identified tryptic-digested proteins 8-11. In this study, we upgraded the ultrafiltration sampling technique by creating a lollipop-like ultrafiltration (LLUF) probe that can easily fit in the human oral cavity. The direct analysis by LC-MS without trypsin digestion showed that human saliva indigenously contains many peptide fragments derived from various proteins. Sampling saliva with LLUF probes avoided centrifugation but effectively removed many larger and high abundance proteins. Our mass spectrometric results illustrated that many low abundance peptides became detectable after filtering out larger proteins with LLUF probes. Detection of low abundance saliva peptides was independent of multiple-step sample separation with chromatography. For clinical application, the LLUF probes incorporated with LC-MS could potentially be used in the future to monitor disease progression from saliva.

Considering saliva sampling for future clinical application, a lollipop-like ultrafiltration (LLUF) probe was fabricated to fit in the human oral cavity. Direct analysis of undigested saliva by NanoLC-LTQ mass spectrometry demonstrated the ability of LLUF probes to remove large proteins and high abundance proteins, and make low-abundant peptides more detectable.

רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

Although human saliva proteome and peptidome have been revealed 1-2 they were majorly identified from tryptic digests of saliva proteins. Identification ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a reliable and robust method for genotyping individuals by Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) analysis in the context of undergraduate laboratory classes. The human D1S80 VNTR locus is used in this protocol as a highly polymorphic marker based on variation in the number of repetitive sequences.
This simple protocol conveys useful information for teachers and the implementation of DNA fingerprinting in practical laboratory classes. In the presented laboratory exercise, DNA extraction followed by PCR amplification is used to determine genetic variation at the D1S80 VNTR locus. Differences in the fragment size of PCR products are visualized by agarose gel electrophoresis. The fragment sizes and repeat numbers are calculated based on a linear regression of the size and migration distance of a DNA size standard.
Following this guide, students should be able to:
&#8226;&#160; Harvest and extract DNA from buccal mucosa epithelial cells 
&#8226;&#160; Perform a PCR experiment and understand the function of various reaction components 
&#8226;&#160; Analyze the amplicons by agarose gel electrophoresis and interpret the results 
&#8226;&#160; Understand the use of VNTRs in DNA fingerprinting and its application in biological sciences

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Here we describe a simple protocol to generate DNA fingerprinting profiles by amplifying the VNTR locus D1S80 from epithelial cell DNA.

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data may include mobile genetic elements, such as plasmids and extrachromosomal phage, that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance and further complicate treatment of urinary tract infection (UTI). In addition to providing fine resolution of genome structure, complete, closed genomes allow for the detailed comparative genomics and evolutionary analyses. The generation of complete genomes de novo has long been a challenging task due to limitations of available sequencing technology. Paired-end Next Generation Sequencing (NGS) produces high quality short reads often resulting in accurate but fragmented genome assemblies. On the contrary, Nanopore sequencing provides long reads of lower quality normally leading to error-prone complete assemblies. Such errors may hamper genome-wide association studies or provide misleading variant analysis results. Therefore, hybrid approaches combining both short and long reads have emerged as reliable methods to achieve highly accurate closed bacterial genomes. Reported herein is a comprehensive method for the culture of diverse urinary bacteria, species identification by 16S rRNA gene sequencing, extraction of genomic DNA (gDNA), and generation of short and long reads by NGS and Nanopore platforms, respectively. Additionally, this method describes a bioinformatic pipeline of quality control, assembly, and gene prediction algorithms for the generation of annotated complete genome sequences. Combination of bioinformatic tools enables the selection of high quality read data for hybrid genome assembly and downstream analysis. The streamlined approach for the hybrid de novo genome assembly described in this protocol may be adapted for the use in any culturable bacteria.

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

This protocol details a comprehensive approach for the culturing, sequencing, and de novo hybrid genome assembly of urinary bacteria. It provides a reproducible procedure for the generation of complete, circular genome sequences useful in studying both chromosomal and extrachromosomal genetic elements contributing to urinary colonization, pathogenesis, and antimicrobial resistance dissemination.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

Large-Scale SARS-CoV-2 Testing Utilizing Saliva and Transposition Sample Pooling

Identification and isolation of contagious individuals along with quarantine of close contacts, is critical for slowing the spread of COVID-19. Large-scale testing in a surveillance or screening capacity for asymptomatic carriers of COVID-19 provides both data on viral spread and the follow-up ability to rapidly test individuals during suspected outbreaks. The COVID-19 early detection program at Michigan State University has been utilizing large-scale testing in a surveillance or screening capacity since fall of 2020. The methods adapted here take advantage of the reliability, large sample volume, and self-collection benefits of saliva, paired with a cost-effective, reagent conserving two-dimensional pooling scheme. The process was designed to be adaptable to supply shortages, with many components of the kits and the assay easily substituted. The processes outlined for collecting and processing SARS-CoV-2 samples can be adapted to test for future viral pathogens reliably expressed in saliva. By providing this blueprint for universities or other organizations, preparedness plans for future viral outbreaks can be developed.

The protocol is intended to serve as a blueprint for universities and other organizations considering large-scale testing for SARS-CoV-2 or developing preparedness plans for future viral outbreaks.

Identification and isolation of contagious individuals along with quarantine of close contacts, is critical for slowing the spread of COVID-19. ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biology

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...