Name: high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לילדים ולתורמי פלזמה למבוגרים, וצוות בפפואה גינאה החדשה המכון למחקר רפואי. המחברים מבקשים להודות לAmandine B Carmagnac, קתרין ש Nie, דני W וילסון, איבו מולר ודיאנה S הנסן על תרומתם לפיתוח של טכניקה זו, ותודה לצלב האדום האוסטרלי לחבילות דם וסרום. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני ממשלת המדינה תפעולית תשתיות ואוסטרלית הממשלה NHMRC IRIISS. עבודה זו נתמכה על ידי הבריאות הלאומית מועצה למחקר רפואית מעניק # 1031212 ו# 637,406, ומכונים הלאומיים לבריאות מענק # AI089686.

<ol>
	<li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria.">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li><li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G., Medicine, P. L. o. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+anti-merozoite+antibodies+and+incidence+of+Plasmodium+falciparum+malaria:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Medicine. 7, (2010).</li><li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro,+but+act+in+cooperation+with+monocytes.">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li><li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII.">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, 3099-3106 (1950).</li><li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea.">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li><li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine.">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li><li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome.">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li><li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria.">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72 (2007).</li><li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection.">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria.">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies.">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry.">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li><li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development.">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte:+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis.">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li><li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development.">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li><li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum.">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li><li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite.">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte.">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite.">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion.">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li><li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture.">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li><li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+immunity+to+malaria.">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li><li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites.">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria.">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays.">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152 (2010).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase.">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li><li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms.">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li><li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa.">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li><li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals.">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li><li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line.">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li><li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro.">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li><li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonopsonic+monocyte/macrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes:+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance.">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כדי למדוד phagocytosis merozoite, בקיאות בשתי טכניקות נדרש: טיהור של merozoites וassay phagocytosis THP-1. השלבים הקריטיים ביותר לשילוב של שתי טכניקות אלה הם: 1) טפילים מסונכרנים היטב; 2) הוספת E64 בזמן הנכון כדי להניב merozoites המוקף קרום; 3) הסרת hemozoin להימנע מצרפים; 4) ספירת merozoite מדויקת על ידי cytometry זרימה; 5) הדילול של פלזמה משמשת; ו6) שמירה על צפיפות תא נמוכה ומספר מעבר של THP-1 תאים. בחינה קפדנית של היבטים המרכזיים אלה תבטיח תגובות phagocytosis חזקות הם נצפו. אמנם, מתואר כאן היא הכנת merozoites להערכת phagocytosis, הטכניקה יכולה להיות מנוצל עבור מגוון רחב של יישומים. ללא קשר למתודולוגיה הזרם למטה, הכנות merozoite אופטימליות תלויות בעיתוי נכון בנוסף E64 על מנת ליצור merozoites. שיטת E64 המתוארת כאן הוכח yIELD merozoites פולשנית לשימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של אירועי פלישה ומבחני רגישות הסמים 15-20. בעוד כדאיות merozoite אינה חיונית לphagocytosis, נדרשת יושרה של מעיל משטח merozoite. לכן שיטת E64 המתוארת כאן מאפשרת merozoites באיכות גבוהה כדי להיות מיוצר להערכת תגובת נוגדנים למעייל פני השטח. כפי שמתואר באיור 1, אם E64 מתווסף מוקדם מדי או מאוחר מדי merozoites הקרום סגור לא נוצרים. מסיבה זו, תרבויות טפיל סינכרוני מאוד נדרשות. כאן, השימוש בטיפולי סורביטול והפרין לחוזקה לסנכרן תרבויות טפיל D10-GFP לחלון של שעה 2 הוא תאר. הפרין יכול לקדם gametocytogenesis במעבדה אחרת מבודדת, ולכן יש להשתמש בזהירות. עשויות לשמש גם שיטות סנכרון אלטרנטיביים כגון אלנין, ובלבד שטפילים מסונכרנים היטב מיוצרים 29. אם E64 מתווסף לטפילי אסינכרוני, אבזר נמוךortion של merozoites מוקף קרום יופק ונותר טפיל שנדבק ב-RBC יהיה גם קרע בדרך כלל או לפתח מורפולוגיה נורמלית. נוכחותם של טפילים שלא התפתחה לmerozoites קרום סגור תגרום לסתימה של המסנן ולהפחית באופן משמעותי את תשואת merozoite מתקבלת. במהלך הסינון של merozoites המוקף בממברנה, hemozoin הוא משוחרר מוקואולות העיכול וקיים כגבישים חופשיים בתמיסה. Hemozoin הוא מעודדי דלקת מאוד וכבר דווח לווסת תגובות מונוציטים וphagocytosis מקרופאג 30, ביום 31. בנוסף לויסות phagocytosis, כפי שמוצג באיור 2, hemozoin יכול ליצור אגרגטים עם merozoites בתמיסה. כTHP-1 תאים יכולים phagocytose אגרגטים אלה, זה יכול להיות confounder עיקרי להחלטה של ​​phagocytosis בתיווך הנוגדנים. לכן, הסרת hemozoin יש צורך בassay זה לאבמורכבות נוספות של OID hemozoin על ביולוגיה תא בלען. בנוסף, אי ספיקת כדי להסיר hemozoin יכולה להיות גם הרסנית בעת השימוש בטכניקה זו כדי ליצור merozoites ללא תשלום עבור יישומים אחרים, במיוחד שבו נדרש כימות merozoite. כפי שמתואר באיור 4, מספר merozoites הוסיף לassay יכול להשפיע על מידת phagocytosis ידי THP-1 תאים. למרות cytometry הזרימה מאפשר ספירה של ריכוז merozoite, pipetting זהיר ולשכפל את הסעיפים של merozoites נחוץ כדי לשפר את הדיוק. זה קריטי במיוחד אם קווי טפיל מרובים הם להיבדק Side-by-צד. זה בעבר כבר הראה כי פלזמה מילדים למחצה חסינים מפני PNG יכולה להיות מדולל באופן משמעותי לפני תגובות ירידת 23. שתואר כאן הוא הדילול האופטימלי של פלזמה (1/120, 000 הדילול סופי של פלזמה) לקבוצה של 5 - ילדי PNG בת 12 שהפיקה את מגוון הגדול של phagocyt. תגובות אוזיסים המתוארות באיור 5 טווח זה אפשר לריבוד של תגובות לארבע קבוצות (0 - 19%, 20-39%, 40-59% ו60 - phagocytosis 79%), ומודלים רגרסיה חשפו כי תגובות opsonizing היו קשורות עם ההגנה מפני מחלה קלינית וצפיפות גבוהה parasitaemia 10 לעוקבה שונה לומדת ייתכן שיהיה צורך להתאים את דילול פלזמה כדי להבטיח phagocytosis ידי THP-1 תאים לא רווי או מתחת לרמה של זיהוי. Cytometry זרימה מאפשרת phagocytosis המהיר וכימות עם דיוק משופר על מיקרוסקופ. פרוטוקול זה הוא תפוקה גבוהה, צלחת מבוססת ואוטומטי רכישת 96 צלחות גם ללמוד חסינות הלחות שנרכשה באופן טבעי. השיטה דורשת צביעת merozoites ברומיד ethidium, יכולים להיות מנוצלים כתמי DNA אלטרנטיביים לעומת זאת, כגון SYBRgreen, DAPI ויוד propidium, כתמי קרום או כתמי חלבון. assay זה יהיה מקובל Primarמונוציטים y או נויטרופילים, ויכולים להיות מותאמים אם תא בלען או הביולוגיה FCR היה של עניין. תאים ראשוניים או THP-1 תאים מובחנים במבחנה עם PMA יכולים לשמש כדי לחקור phagocytosis במלריה ופתוגנים אחרים 12, 32-34. עם זאת שימוש בתאים ראשוניים עשויה להיות מאתגר כפי שהתאים אלה הם חסיד וגם להציג phagocytosis שאינו הנוגדן בתיווך 35. בנוסף, השתנות בטהרה, כדאיות ופונקציונליות כמה מגבלות מפתח לשימוש בתאי phagocytic העיקריים. קולטני Fc המעורב בphagocytosis merozoite יישאר uncharacterized, ולכן באמצעות חסימת נוגדנים לקולטניים Fc ספציפי יכולה להבהיר את תרומתו של כל מועדון כדורגל קולטן לmerozoite phagocytosis. כphagocytosis THP-1 הוא FCR תלוי, זה מאפשר פירוש פשוט של phagocytosis נצפה. assay זה גם משאיל את עצמו לטיפול ספציפי אנטיגן של opsonizing נוגדנים אשר יכולים להיות מושגת על ידי utilizing טפילים עקום החוצה לפני שטח אנטיגנים merozoite, או באמצעות נוגדנים אנושיים מטוהרים זיקה לmerozoite חלבוני פני השטח. יתר על כן, בעומק מחקרים של תגובות ציטוקינים הבאים phagocytosis merozoite חסרים, ויכולים להיות מושגת באמצעות assay זה. שתי טכניקות אלו מהוות התקדמות ניכרת בחקר נוגדני antimerozoite הפונקציונליים. טיהור merozoites באיכות גבוהה יש יתרון לשימוש בmerozoites cryopreserved, או זעירים מניאון מצופה באנטיגנים merozoite. למרות assay זה כבר נעשה שימוש ככלי להערכת חסינות שנרכשה באופן טבעי, זה עשוי להוכיח כלי חשוב להתמודדות עם הרכישה של חסינות בתגובה לחיסון. למרות שזה הוכח לאחרונה כי phagocytosis או merozoites opsonised קשור להגנה מפני מלריה קלינית, לא ניתן להסיק מסקנות ישירות מphagocytosis THP-1 במבחנה לin vivo phagocytoאחות של merozoites כphagocytosis בassay זה מתרחשת תחת תנאים סטטיים ובהעדר מתחרה בתאי דם אדומים. ההתאמות הפוטנציאליות של assay זה עשויות כך לספק כלי תכליתי להבנה נוספת של מלריה וphagocytosis merozoite.

החשיבות של נוגדנים לחסינות למלרית falciparum Plasmodium הוצגה לפני 40 שנה, כאשר אימונוגלובולינים ממבוגרי ההיפר הועברו באופן פסיבי לילדים הסובלים ממלריה חמורה וכתוצאה מכך המחלה להקל 1. כתוצאה מכך, מאמץ ניכר בקש לזהות מטרות של חסינות מלריה מגן, בעיקר באמצעות מדידת טיטר נוגדנים לפפטידים או חלבונים הביעו bacterially ידי ELISA. סרולוגיה מבוססת ELISA הוכיחה גם משתנה מאוד בין לימודים, ואינה מתייחסת לנוגדנים פונקציונלי 2. אנטיגנים מלריה רבים לגרום IgG1 cytophilic ופרופיל נוגדן IgG3, במיוחד פני השטח אנטיגנים merozoite 3. הטיה תת הדבר מצביעה על כך אינטראקציות נוגדן-FC-קולטן (FCR) עם phagocytes חשובות לפונקציות מפעיל של opsonizing נוגדני antimerozoite 4. חיסוני אנטיגן merozoite כמה בפיתוח נועדולעורר פונקציות תא בלען מפעיל 5, 6 ולמרות שראיות משמעותיות לחשיבות של אינטראקציות הנוגדן-FCR במודלים של מלריה מכרסם קיימים 7-9, וכמה מחקרים שנעשה לאחרונה תומכים בחשיבות של נוגדנים פונקציונליים ופונקציות מפעיל תא בלען לחסינות למלריה בבני אדם 10, 11, תחום זה עדיין נחקר גרוע. מחקר לנוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היה מוגבל על ידי שני גורמים; הקושי בבידוד merozoites באיכות טובה; ותגובות phagocytosis משתנים מהתאים ראשוניים. עד לאחרונה, מילויים צנטריפוגה במהירות גבוהה או צפיפות Percoll נוצלו כדי לבודד merozoites מsupernatants התרבות של פקיעת תרבויות schizont. merozoites אלה היו מעשי רק לעתים נדירות, ולעתים קרובות מניפולציות נוספות על ידי צנטריפוגה צפיפות ולשטוף מרובים שלבים 12, או הקפאה 11 לפני השימוש במבחנים. proc אלהesses פוטנציאל לנתק חלבונים רבים הקשורים שולי ממשטח merozoite, חלבונים ידועים להיות מטרות אנטיגני של חסינות מלריה 13. לאחרונה מעכבי פרוטאז ציסטאין טרנס Epoxysuccinyl-L-leucylamido בוטאן (4 guanidino-) (E64) נעשה שימוש כדי ליצור merozoites קיימא. E64 מונע קרע schizont, שהניבו merozoites קרום סגור 14, שיכול להיות מופר על ידי סינון לשחרר merozoites קיימא 15, 16. טכניקה זו תוביל לרזולוציה מרחבית של חלבונים רבים במהלך הפלישה כדורית אדומה 15, 17-19 והבהירה את ההשפעה הספציפית השלב של כמה תרופות נגד מלריה 16, 20. עם זאת, הדור של merozoites קיימא נותר מאתגר מבחינה טכנית. כדי לסייע בהפצה של טכניקה זו ויישום למבחנים תפקודיים של חסינות, פרוטוקול מפורט לטיהור קיימא merozoite והשימוש בם בassay הסטנדרטי הפונקציונלי של נוגדן: שיתוף פעולה סלולארי בopsonization וphagocytosis מתואר כאן. טכניקה זו מדגימה התקדמות משמעותית לעומת מבחני קודמים במבחנה של opsonization merozoite, כגון פרץ נויטרופילים נשימה, תלוי נייד עיכוב הנוגדן (ADCI), ומבחני phagocytosis merozoite חלופיים. מבחני אלה הם גרועים לשחזור עקב וריאציה בתשומות טפיל ואת פעילותם של תאים ראשוניים phagocytic 11, 21. hemozoin לזהם גם עשוי מאוד להשפיע על תפקוד התא בלען 22. Assay phagocytosis merozoite חזק לשעתק דיווח לאחרונה 23 מנצל את שורת תאי promonocytic THP-1 24. זה סוג תא אידיאלי עבור מבחני זרימת cytometry תפוקה גבוהה כפי שהוא לא חסיד ובמיוחד מבצע phagocytosis FC-קולטן בתיווך 25, 26. מורכבות נוספות בזמן investigating phagocytosis הוא שהתואר של phagocytosis תלוי במספר merozoites ביחס לTHP-1 תאים וריכוז בפלזמה. כדי להבטיח שחזור בין ניסויים, צריך להיות מנת merozoites וריכוז מוגדר בשימוש. בשל גודלם הזעיר, לזרום כימות cytometric נדרש. ההליך המתואר כאן מסיר hemozoin ומייצר merozoites קיימא, ומתאר את היישום של merozoites אלה לספירת התזרים cytometric של merozoites אחרי opsonization וphagocytosis. למרות תובעני מבחינה טכנית, הטכניקות המתוארות עשויות להיות שימושיות בהבהרת התרומה של תגובות נוגדנים ספציפיות למשטח merozoite נרכש באופן טבעי וחיסון מושרה חסינות.

<table><tbody><tr><td>THP-1 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapthoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>Use in Fume Hood</td></tr><tr><td>Pen/Strep Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>Cell culture grade</td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Calbiochem</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum&amp;nbsp;</td><td>Donation from Australian Red Cross</td><td></td><td>Available commercially (i.e. Invitrogen)</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Pfizer</td><td>61022027</td><td>Injection Quality</td></tr><tr><td>Heparin Sodium BP (5000 IU/ml)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Porcine origin</td></tr><tr><td>Blasticidin S-hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 Protease Inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>Use for phosphate buffer</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4.&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>Use for phosphate buffer</td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s azur eosin methylene blue solution</td><td>Merck</td><td>1.09204.0500</td><td>1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>Acrodisc Syringe Filters 1.2-&amp;mu;m/32-mm</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4656</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator (for small column)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>Interchangeable with MidiMACS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VarioMACS Separator (for large columns)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS Column (small magnetic column)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Large magnetic column</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Bio-Rad</td><td>1510433</td><td>Cytotoxic</td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>FlowJo cytometry analysis software</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high yield purification of plasmodium falciparum merozoites for use in opsonizing antibody assays

אנטיגנים merozoite falciparum Plasmodium נמצאים בפיתוח כחיסון למלריה פוטנציאלית. היבט אחד של חסינות מפני מלריה הוא הסר של merozoites החופשי מהדם על ידי תאי phagocytic. עם זאת הערכת היעילות התפקודית של נוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היא מאתגרת בשל זמן מחצית החיים קצרים של merozoites וההשתנות של תאי phagocytic עיקריים. תאר בפירוט במסמך זה שיטה ליצירה merozoites קיימא באמצעות מעכבי פרוטאז E64, וassay של merozoite phagocytosis opsonin תלוי באמצעות שורת התאים פרו monocytic THP-1. E64 מונע קרע schizont תוך מתן אפשרות לפיתוח של merozoites אשר שוחרר על ידי סינון של schizonts טופל. merozoites רומיד Ethidium שכותרתו opsonized עם דגימות פלזמה אנושיות, והוסיף לTHP-1 תאים. Phagocytosis נבחנים על ידי פרוטוקול תפוקה גבוהה סטנדרטי. merozoites קיימא הוא משאב יקר ערך להערכת numerהיבטים מפוקפקים של פ הביולוגיה falciparum, כולל הערכה של תפקוד מערכת החיסון. רמת נוגדנים שנמדדה על ידי assay זה קשור עם חסינות קלינית למלריה באנשים שנחשפו באופן טבעי. Assay יכול להיות גם שימוש להערכת נוגדני חיסון מושרה.

שלב ההבשלה של טפילים לפני טיפול E64 הוא קריטי ליצירה merozoites מוקף קרום. איור 1Ai מציג את שלב ההבשלה המתאים של schizonts להוספת E64. הטפילים צריכים להיות גדולים וכמעט למלא את תא הדם האדום. מראה מנומר של כתם Giemsa מציין merogony החל, ויש להוסיף E64 להניב merozoites מוקף קרום (איור 1Aii). אם E64 הוא הוסיף קודם לכן לtrophozoite טפילי במה, merozoites המוקף הקרום לא נוצרים גם לאחר 12 שעות של E64. במקום טפילים לקחת על מורפולוגיה חריגה כגון הגדלה של vacuole העיכול (איור 1Bi ו1Bii), וmerozoites לא נוצרים. אם E64 הוא הוסיף מאוחר יותר לschizonts, merozoites מוקף קרום לא נוצרים כקרע schizont חסר עכבות (איור 1Ci ו1Cii). רמה גבוהה של תיאום טפיל נדרש, אחרחכם טווח של כל שלוש התוצאות שתוארו יהיה לראות לאחר טיפול E64. הסרת hemozoin היא עוד צעד קריטי עבור merozoites לטיהור. אם merozoites אינו מטוהרים מhemozoin אז אשכולות merozoite-hemozoin צורה שלא ניתן וחילצה ידי pipetting. אגרגטים אלה לרוץ על cytometer כאירועים בודדים, אם כי עם מאפיינים צופה פני פיזור ותופעות פיזור שונים מmerozoites אחת, וכתוצאה מספירת merozoite לא מדויקת על ידי cytometry זרימה (איור 2 א). כTHP-1 תאים יכולים גם phagocytose hemozoin, יכולים גם להיות phagocytosed אשכולות merozoite-hemozoin אלה (איור 2). אגרגטים אלה ניאון EtBr מאוד כפי שהם מכילים merozoites מרובה. Phagocytosis של תוצאות אגרגטים במקבילים פרופיל הקרינה EtBr THP-1 לזה שנצפה עבור phagocytosis של merozoites הבודד מרובה. לפיכך, אם hemozoin לא הוסר, הקרינה EtBr של THP-1 תאים תהיה overestimate של פוטנציאל opsonizing לפלזמה הנבדקת. Hemozoin הוא דיווח גם לשנות את תפקוד תא בלען באופן משמעותי. merozoites GFP החיובי הם מוכתמים דלפק עם EtBr להגדיל את ההדמיה של merozoites phagocytosed ידי THP-1 תאים. שימוש בתנאים שתוארו בפרוטוקול זה, כל merozoites GFP החיובי הם counterstained עם EtBr שבו יש עוצמת הקרינה בהירה (איור 3 א). הערכת Phagocytosis ידי הקרינה EtBr מאפשרת רזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite מאשר הקרינה ה-GFP (איור 3 ב). מספר merozoites הוסיף לassay יהיה לווסת את כמות phagocytosis נצפתה. מסיבה זו, ספירה מדויקת על ידי cytometry זרימה היא קריטית. הגדלת יחס של merozoites: THP-1 תגרום לדבקות המוגברת של merozoites לTHP-1 תאים בהעדר הפלזמה (איור 4 א). הגדלת merozoite: THP-1 יחסים גם תוצאות ph המוגברתגובות agocytosis כאשר merozoites הם opsonized (איור 4). Merozoite 4:1: יחס THP-1 מומלץ לתגובות phagocytic חזקות. באמצעות יחס זה, והדילול של פלזמה מצויינים, assay זה הוא מסוגל לפתור רמות נמוכות, בינוניות וגבוהות של נוגדני opsonizing. בין 0 ל 78 תגובות phagocytosis אחוזים נצפו באמצעות דגימות פלזמה PNG ומצבים האחרים שתוארו. תגובות כאלה מוצגות לאחרונה מקשרים עם חסינות קלינית שנרכשה באופן טבעי למלריה 10. איור 5 מראה דוגמאות של 4 הרבעונים של תגובות phagocytosis מאנשים PNG. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. עיתוי בנוסף E64 הוא קריטי ליצירה merozoites המוקף בממברנה. () Maturatio המתאים. שלב n של טפילי i) לפני טיפול E64, וii) merozoites מוקף קרום הופק לאחר 6 שעות של טיפול E64 (merozoites הסגור ב &#39;) קרום לא נוצרים אם E64 מתווסף לטפילים לא בשלה; i) trophozoites בשלב מאוחר, וii) לאחר 12 שעות של E64 (C) schizont קרע לא עכבות אם E64 מתווסף מפולחים מאוחר schizonts.; i) schizonts שלב המאוחר, וii) לאחר 6 שעות של E64. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הסרת Hemozoin היא קריטית כדי ליצור השעיה merozoite תא בודד. אגרגטים Merozoite-hemozoin הטופס הבא סינון של merozoites המוקף הקרום, אלא אם כן hemozoin מופרד מגנטי מmerozoites. () חלקות צופה פני פיזור וצד פיזור של merozoites עם hemozoin הוסרוhemozoin עודפים. ניתן phagocytosed אגרגטים (ב &#39;) Hemozoin-merozoite ידי THP-1 תאים. שקופיות ציטומגלווירוס ספין מוכתמות הבדל-מהיר של תאי THP-1 הודגרו עם הפלזמה PNG opsonized הכנות merozoite עם או בלי hemozoin. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. מכתים Ethidium רומיד מאפשר לרזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite. Merozoites מטוהר D10-GFP הם counterstained עם EtBr כדי לשפר את עוצמת הקרינה. () Cytometry זרימת histrogram של merozoites מטוהר עם gating על merozoites GFP החיובי, וכתם נקודה מראה EtBr הקרינה בתוך אוכלוסיית ה-GFP מגודרת זה חיובי. (ב) פיזור קדימה לעומת GFP ופיזור קדימה לעומת EtBr של THP-1 תאים הבאים phagocytosis של merozoites ניאון הכפול GFP וEtBr. שערים היו ד<html> rawn המבוסס על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 merozoite:. יחס THP-1 משפיע על מידת phagocytosis נצפתה. (א) חמש merozoite: THP-1 יחסים מתוארים; 50:1, 20:01, 10:01, 4:1, 1:1. שליטה רק תאים מצביעה על הקרינה רקע עקב THP-1 תאים. הקרינה EtBr THP-1 עבור כל יחס מצויינים לmerozoites opsonized עם בריכה של הפלזמה PNG או עם פלזמה אוסטרלית nonimmune ממוצע הקרינה בעוצמה של THP-1 תאים לmerozoite שונה (ב &#39;):. THP-1 יחסים, וopsonization עם בריכה של הפלזמה PNG או פלזמה האוסטרלית nonimmune (ממוצע + SEM). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ove_content &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. מגוון גדול של נוגדני opsonizing ניתן למדוד. Merozoites היה opsonized עם פלזמה מאנשים PNG וטופחו עם THP-1 תאים. ארבע תגובות phagocytosis נציג מוצגות. גייטס היו סגור המבוססת על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה, ומספרים מצביעים phagocytosis% לאחר הפחתה של תאי THP-1 עם שליטת פלזמה שאינה מחוסנת. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays at JoVE.com

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

23.0K Views.  Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research.  מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה. 

Video: High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spectrometer in conjunction with Multivariate Data Analysis (MVDA). 3D7 P. falciparum were cultured to 10% parasitemia ring stage parasites and used to spike fresh donor isolated RBCs to create a dilution series between 0&#8211;1%. 10 &#181;L of each sample were placed onto the center of the ATR diamond window to acquire the spectrum. The sample data was treated to improve the signal to noise ratio and to remove the contribution of water, and then the second derivative was applied to resolve spectral features. The data were then analyzed using two types of MVDA: first Principal Component Analysis (PCA) to determine any outliers and then Partial Least Squares Regression (PLS-R) to build the quantification model.

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Here, we present a protocol for the detection and quantification of Plasmodium falciparum in infected aqueous red blood cells using an attenuated total reflection infrared spectrometer and multivariate data analysis.

זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum ב מימית כדוריות דם אדומות על ידי הקלוש הכולל השתקפות ספקטרוסקופית אינפרא אדום וניתוח נתונים Multivariate

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

Chemistry

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective immunity to malaria is still poorly understood, mainly due to methodological limitations of long-term Plasmodium culture, especially for Plasmodium vivax. Most studies have focused on adaptive immunity protection against malaria by antibodies, which play a key role in controlling malaria. However, the sterile protection induced by attenuated Plasmodium sporozoites vaccines is related to cellular response, mainly to cytotoxic T lymphocytes, such as CD8+ and gamma delta T cells (&#947;&#948; T). Hence, new methodologies must be developed to better comprehend the functions of the cellular immune response and thus support future therapy and vaccine development. To find a new strategy to analyze this cell-mediated immunity to Plasmodium blood-stage infection, our group established an in vitro assay that measures infected red blood cell (iRBC) killing by cytotoxic lymphocytes. This assay can be used to study cellular immune response mechanisms against different Plasmodium spp. in the blood stage. Innate and adaptative cytotoxic immune cells can directly eliminate iRBCs and the intracellular parasite in an effector:target mechanism. Target iRBCs are labeled to evaluate cell viability, and cocultured with effector cells (CD8+ T, &#947;&#948; T, NK cells, etc.). The lysis percentage is calculated based on tested conditions, compared to a spontaneous lysis control in a flow cytometry-based assay. Ultimately, this killing assay methodology is a major advance in understanding cell-mediated immunity to blood-stage malaria, helping uncover new potential therapeutic targets and accelerate the development of malaria vaccines.

In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes

Here we describe a new method to help elucidate the mechanisms of cellular immunity to Plasmodium during the blood stage of infection. This is an in vitro assay that measures infected red blood cell killing by cytotoxic lymphocytes.&#160;

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

Malaria is a major public health concern, presenting more than 200 million cases per year worldwide. Despite years of scientific efforts, protective ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry חלבונים

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Biology

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

<meta charset="utf8"></head><body>זיהוי חיווט מחדש של קינאזות בטפיל מלריה: גישה גנטית כימית

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more pronounced for target genes belonging to the multigene family. Plasmodium falciparum protein kinases belonging to the CDPK family are essential for blood stage development. As such, CDPKs are considered good targets for the development of anti-malarial compounds. The chemical genetics approach has been historically used to elucidate the function of protein kinases in higher eukaryotes. It requires the substitution of gatekeeper residue for another amino acid with a different side chain through genetic manipulation. Amino acid substitution at the gatekeeper position modulates the activity of a protein kinase and changes its susceptibility to a specific class of compounds known as bumped kinase inhibitors (BKIs) that help in the functional identification of the target gene. Here, we have exploited the chemical genetics approach to understand compensatory mechanisms evolved by a mutant parasite harboring a hypomorphic allele of cdpk1. Overall, our approach helps in identifying compensatory pathways that may be simultaneously targeted to prevent the development of drug resistance against individual kinases.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: זיהוי מסלולי פיצוי בטפילי מלריה המכילים אלל היפומורפי של קינאזות חלבון חיוניות

Chemical genetics involves the substitution of a gatekeeper residue with an amino acid containing a different side chain at the target locus. Here, we have generated a mutant parasite containing a hypomorphic allele of cdpk1 and identified compensatory pathways adopted by the parasite in the mutant background.

טיהור תשואה גבוהה של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של

הפרדה

זיהוי, כימות של הפלזמודיום falciparum ב מימית כדוריות דם אדומות על ידי הקלוש הכולל השתקפות ספקטרוסקופית אינפרא אדום וניתוח נתונים Multivariate

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים