Notre équipe étudie les troubles métaboliques, cardiaques, musculaires, du sommeil et du vieillissement à l’aide du modèle de la drosophile. Cet article de Jove détaille le protocole simplifié pour le traitement des tissus cérébraux, y compris la décapitation, la fixation, la cryosection, la coloration et l’imagerie. Mon groupe de recherche a été le pionnier du développement d’un modèle de drosophile pour étudier plusieurs maladies humaines et le vieillissement.
Nous avons également étudié des interventions telles que l’alimentation limitée dans le temps et l’exercice. Nous utilisons l’apprentissage automatique, les omiques et l’approche moléculaire pour étudier des facteurs tels que le rythme circadien et la génétique afin de révéler leur impact sur l’intégrité cellulaire, la physiologie et le comportement. Ce protocole simplifié de recherche sur le cerveau de la drosophile évite les dissections complexes, ne nécessite qu’une seule exécution à une main et élimine le besoin de microscopie confocale coûteuse, augmentant ainsi l’accessibilité et réduisant la dépendance à l’équipement.
Pour commencer, procurez-vous les mouches dans des flacons vieillissants, puis ouvrez la valve sur le tapis de dioxyde de carbone et déversez rapidement les mouches sur le tapis pour éviter qu’elles ne s’échappent. Une fois que les mouches deviennent presque inconscientes, positionnez-les sous le microscope SZ61 en déplaçant le tapis sous la lentille de l’objectif. Ajustez le grossissement et faites la mise au point jusqu’à ce que les mouches soient clairement visibles et confortables à décapiter.
À l’aide de ciseaux à ressort, placez les lames entre le thorax et la tête de la mouche et pressez-les fermement pour décapiter cinq à 10 têtes de mouches par groupe expérimental. Remettez toutes les mouches usagées dans leur flacon de vieillissement. À l’aide d’un pinceau, transférez délicatement les têtes de mouches décapitées dans des tubes étiquetés de 1,5 millilitre placés sur de la glace.
Après avoir retiré les tubes de la glace, pipetez 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % et de PBS dans chaque tube en veillant à ce que toutes les têtes de mouches soient complètement immergées. Si les têtes adhèrent aux parois du tube, poussez-les doucement vers le bas à l’aide d’une brosse ou tapotez légèrement le tube contre une surface horizontale pour assurer un bon contact avec la solution. Ensuite, incubez les tubes pendant 15 minutes sur un agitateur orbital à réglage moyen.
Jetez la solution de paraformaldéhyde et remplacez-la par du PBS, en vous assurant que toutes les têtes de mouches sont immergées. Après le lavage final, transférez les têtes de mouches dans une solution de saccharose à 10 % dans du PBS, en vous assurant qu’elles sont immergées dans le tube. Remplissez un moule étiqueté à environ 50 % de sa capacité avec une température de coupe optimale ou un composé OCT, ce qui lui permet de se propager aux quatre coins du moule.
À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement les têtes de mouches fixes collectées sur la surface du composé OCT à l’intérieur du moule. À l’aide de la pointe de la pince, poussez doucement chaque tête vers le fond du moule, en vous assurant que les yeux sont orientés vers le bas pour une coupe à travers le plan coronal. Alignez soigneusement toutes les têtes dans les dimensions X, Y et Z pour vous assurer que toutes les sections contiendront tous les groupes expérimentaux simultanément.
Après avoir correctement aligné les têtes, placez soigneusement les moules directement dans un congélateur réglé à moins 20 degrés Celsius pour congeler. Une fois que le moule a presque gelé, remplissez l’espace restant avec du composé OCT. Pour la cryosection de moule, appliquez une quantité généreuse de composé OCT sur le dessus du moule pour fixer le mors de mandrin au moule.
Placez le mors à plat sur le dessus et laissez-le geler complètement à l’intérieur du cryostat, ce qui prend généralement cinq minutes. Libérez ensuite le foret et le bloc OCT du moule. Placez le bloc dans le mandrin, en veillant à ce que l’orientation de haut en bas soit maintenue et serrez la clé du mandrin jusqu’à ce que le bloc soit bien en place.
À l’aide des boutons de réglage et des commandes de profondeur du mandrin, alignez le bloc avec la lame. Réglez la largeur de section sur le cryostat à 20 micromètres et coupez chaque tranche à l’aide d’un mouvement lent et constant tout en permettant au verre anti-roulis de capturer chaque tranche. Capturez ensuite les sections à l’aide de diapositives chaudes en touchant la diapositive au bord le plus proche de la section et en laissant la section s’élever sur la diapositive.
Laissez les lames sécher à température ambiante pendant au moins 30 minutes, mais pas plus d’une heure. Prenez les têtes de mouches de drosophile cryosectionnées et utilisez une lame de rasoir pour éliminer tout composé OCT résiduel sur les bords de la lame, en laissant de l’espace pour une bordure hydrophobe. Ensuite, utilisez un marqueur hydrophobe pour tracer une bordure autour de chaque diapositive et laissez-la sécher pendant cinq minutes.
Lavez toutes les lames trois fois pendant cinq minutes chacune à l’aide de PBS en pipetant doucement sur la lame. Après avoir lavé les lames, pipetez 3 % BSA dans une solution saline tamponnée de Triple sur les lames et incubez pendant 30 minutes à une heure. Ensuite, jetez la solution bloquante et pipetez la solution d’anticorps primaire sur les lames.
Incuber l’anticorps pendant la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant une heure à température ambiante à l’aide de lingettes humides pour éviter le dessèchement. Jetez la solution d’anticorps primaire et lavez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune à l’aide de PBS. Ajoutez ensuite la solution d’anticorps secondaire dans les lames et incubez pendant une heure à température ambiante.
Après avoir lavé les lames trois fois avec du PBS, ne laissez qu’une petite quantité de PBS sur la diapositive. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, ajoutez trois à cinq gouttes de support de montage durcissant contenant du DAPI uniformément sur la lame. Placez une lamelle sur la glissière en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme pendant la mise en place.
Manipulez avec précaution les diapositives fraîchement montées et rangez-les à plat jusqu’à ce que le support de montage soit complètement sec. Si un stockage à long terme est nécessaire, scellez les bords des lames. Prenez des images des lames dès que possible pour minimiser la décomposition fluorescente.
Pendant l’acquisition de l’image, concentrez-vous sur chaque sujet unique dans le même canal pour assurer la cohérence dans tous les groupes expérimentaux. Calibrez les expositions pour chaque canal afin d’éviter la surexposition dans tous les canaux sélectionnés. Assurez-vous que les expositions sélectionnées restent constantes et conviennent à tous les sujets, en particulier entre les différents groupes expérimentaux.
L’expression de l’anticorps ApoE était clairement localisée dans les régions cérébrales des échantillons Elav+ et Elav-ApoE4. L’accumulation de lipides était indiquée par une coloration rouge du Nil, qui était visible dans les régions du cerveau dans les deux génotypes.
