Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

Les techniques à molécule unique sont des outils puissants pour étudier la mécanique, la coordination et la composition des systèmes de chromatine. Et par conséquent, les chercheurs sont toujours à la recherche de meilleures méthodes pour générer des substrats de nucléosomes. Nous décrivons ici un protocole permettant de former des nucléosomes à travers l’ADN en C2 à l’aide d’un microscope à force corrélative et à fluorescence à molécule unique.

En règle générale, les substrats de nucléosomes sont fabriqués en assemblant des nucléosomes sur de l’ADN contenant des séquences de positionnement fortes via la dialyse saline. Bien que cela présente des avantages, il génère des nucléosomes artificiellement stables et est lourd avec des réactifs. Notre protocole prépare les substrats de nucléosomes pour la microscopie à force corrélée à une molécule unique et à fluorescence sans séquences d’ADN spécifiques et avec beaucoup moins de réactifs, le tout en quelques minutes.

Ce protocole permet l’assemblage de nucléosomes sur des séquences d’ADN natif, un ajustement facile de la densité des nucléosomes, ainsi qu’une réduction du temps de préparation et de l’utilisation de réactifs. De plus, la formation d’attaches d’ADN nucléosomale dans C2 permet un flux de travail expérimental plus simple et la commodité de la visualisation et de la manipulation intégrées d’une molécule unique. Lorsque le positionnement uniforme et spécifique des nucléosomes n’est pas une partie essentielle de l’expérience, nos résultats peuvent aider les scientifiques à étudier plus efficacement la chromatine et ses protéines minières au niveau de la molécule unique.

Avec le temps et les ressources économisés, d’autres expériences peuvent être réalisées pour approfondir l’étude de variables et de conditions supplémentaires. Les domaines de recherche applicables auxquels nous réfléchissons actuellement comprennent la mécanique de la chromatine qui est régulée par les variantes d’histones et d’autres modifications post-traductionnelles. Nous réfléchissons également aux engagements biophysiques et à la cinétique d’autres protéines de liaison à la chromatine.

Enfin, nous pensons également aux processus d’assemblage d’ordre supérieur induits par les nucléosomes, tels que la condensation biomoléculaire.