Le poisson zèbre transgénique s’est avéré essentiel à notre compréhension du développement embryonnaire. Le système Tol2 est un outil polyvalent qui permet aux chercheurs de générer rapidement et systématiquement plusieurs poissons-zèbres transgéniques pour les études sur l’ETCAF. La conception modulaire et la facilité de génération de nouveaux composants du kit font du système Tol2 un outil polyvalent pour générer de nouveaux transgéniques sans avoir à redessiner les composants du kit.
Mon conseil aux chercheurs qui pratiquent cette technique pour la première fois est de faire plusieurs essais pour s’entraîner à la précision de la génération et de l’injection de constructions transgéniques. Pour commencer, linéariser le plasmide du kit Tol2 contenant de la transposase avec une endonucléase de restriction nulle en combinant 10 microlitres de plasmide transposase, 1,5 microlitre de tampon de réaction de l’endonucléase de restriction et 0,3 microlitre d’endonucléase nulle dans un tube microcentrifuge de 500 microlitres. Remplissez la réaction jusqu’à 20 microlitres avec de l’eau sans ARNase.
Mélanger et digérer à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, arrêtez la digestion en ajoutant un microlitre d’EDTA 0,5 molaire, deux microlitres d’acétate d’ammonium molaire et 80 microlitres d’éthanol à 100% au mélange réactionnel. Mélanger et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, centrifuger et aspirer le surnageant avant de remettre en suspension la pastille d’ADN dans de l’eau aRNASE. Ensuite, déterminez la concentration plasmidique linéaire en nanogrammes par microlitre sur un fluoromètre en faisant couler deux microlitres de l’échantillon. Configurez la production d’ARNm SP6 en combinant 10 microlitres de NTP / CAP 2X, deux microlitres de tampon de réaction 10X, 0,1 à un microgramme de matrice d’ADN linéaire dans deux microlitres de mélange d’enzymes SP6 dans un tube de 500 microlitres.
Remplissez la réaction jusqu’à 20 microlitres avec de l’eau sans ARNase et mélangez avant d’incuber à 37 degrés Celsius. Après deux heures, ajoutez un microlitre d’ADNASE, mélangez bien et incuber pendant 15 minutes supplémentaires. Arrêtez la réaction en ajoutant 30 microlitres de solution de précipitation de chlorure de lithium.
Mélanger et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, centrifuger la solution pour granuler l’ARNm et aspirer le surnageant avant de laver la pastille avec un millilitre d’éthanol à 80%. Sécher la pastille à l’air libre et la remettre en suspension dans 20 microlitres d’eau sans ARNase.
Déterminer la concentration d’ARNm à l’aide d’un fluoromètre, puis aliquote 100 nanogrammes d’ARNm par tube à usage unique et stocker à moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer la réaction, recueillir 10 femtomole chacun de P5E, PME et P3E et 20 femtomole du vecteur de destination PDEST. Identifier la taille des quatre vecteurs et paires de bases à partir de la source plasmidique.
Après avoir déterminé la concentration des quatre vecteurs, en utilisant le poids de l’ADN comme 660 grammes par mole et la taille du plasmide et les paires de bases, calculer le nombre total de nanogrammes de plasmide nécessaires pour atteindre 10 femtomole pour les vecteurs d’entrée ou 20 femtomole pour le vecteur de destination. Ensuite, générez la construction sox17:EGFP-CAAX en utilisant les composants décrits dans le manuscrit. En utilisant la concentration plasmidique, calculez les microlitres totaux de chaque plasmide nécessaires pour atteindre 10 femtomole ou 20 femtomole, puis divisez cela par deux pour l’utilisation dans les réactions de demi-LR de cinq microlitres.
Générer 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) et 20 femtomole de vecteur de destination. Mettre en place cinq microlitres de réaction demi-LR en combinant les volumes de P5E, PME, P3E et PDEST dans un tube de 500 microlitres. Ajoutez ensuite de l’eau stérile pour faire le volume quatre microlitres.
Vortex le mélange d’enzymes LR deux fois pendant une minute chacun avant d’ajouter un microlitre à la réaction et bien mélanger avant d’incuber à 25 degrés Celsius. Le lendemain, arrêtez la réaction LR en ajoutant 0,5 microlitre de protéinase K.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidir à température ambiante. Ensuite, transformez trois à quatre microlitres du plasmide en cellules chimiquement compétentes décongelées en ajoutant le plasmide et en laissant les cellules reposer sur de la glace pendant 25 à 30 minutes.
Ensuite, choc thermique les cellules dans un bain-marie de 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Après le choc thermique, ajoutez 250 microlitres de milieux liquides riches sans antibiotiques aux cellules et incuber en agitant à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Étaler 300 microlitres de suspension bactérienne sur une plaque d’ampicilline Luria-Bertani et incuber pendant une nuit.
Le lendemain, dépister les colonies pour détecter la présence de deux phénotypes : clair et opaque. Choisissez les colonies claires une à la fois, inoculez la culture liquide et agitez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Combinez 150 nanogrammes de plasmide, 100 nanogrammes d’ARNm de transposase et 2% de rouge de phénol sur glace.
Ajoutez ensuite de l’eau sans ARN pour obtenir un volume de trois microlitres. Transférer un embryon au stade cellulaire à l’aide de pipettes de transfert dans la plaque d’injection remplie d’EM recouvrant complètement la gélose puis appuyer doucement sur environ 50 à 75 embryons par fente de la plaque d’injection. Ajouter le mélange de rouge de phénol plasmidique d’ARNm à l’extrémité ouverte d’une aiguille d’injection capillaire.
Placez l’aiguille capillaire dans l’armature de l’appareil d’injection et allumez l’appareil d’injection. Abaissez l’aiguille dans la plaque d’injection et cassez l’embout à l’aide d’une pince pour ne permettre qu’à une petite quantité de mélange d’être pompée par l’appareil d’injection. Injectez aux embryons un bolus de trois nanolitres du mélange de rouge de phénol plasmidique d’ARNm dans le corps cellulaire de l’embryon.
Lorsque vous avez terminé, retirez les embryons de la plaque d’injection en les sortant doucement de la fente et transférez-les en les pipetant dans une boîte de Petri de 100 millimètres avec EM frais. Incuber à 28,5 degrés Celsius. Choisissez le stade de développement approprié pour l’expression des transgènes fluorescents et dépister au microscope à dissection fluorescente. Dépister les transgènes non fluorescents en criblant les marqueurs transgéniques fluorescents tels que la GFP pilotée par le promoteur cardiaque spécifique du gène Cmlc2.
Lorsque les embryons positifs pour l’insertion transgénique se développent chez les adultes et atteignent l’âge de reproduction, les dépister individuellement pour la transmission germinale et l’expressivité transgénique en les élevant en poisson zèbre de type sauvage. Des exemples de colonies bactériennes obtenues à partir de la transformation de la recombinaison LR sont présentés. Les colonies transparentes contenaient un produit de recombinaison LR correct plus de 85% du temps, tandis que les colonies opaques ne contenaient jamais de produit de recombinaison correct.
La digestion diagnostique des trois colonies à partir de la transformation des produits de recombinaison LR a montré que la seule colonie opaque ne contenait aucun plasmide, tandis que les deux colonies claires contenaient une seule bande à 9 544 paires de bases. L’ARNm transposase à 1 950 paires de bases est illustré ici. L’expression de l’endoderme en mosaïque EGFP-CAAX a été observée dans 75% des embryons injectés.
L’expression de marqueurs transgéniques de Cmlc2 EGFP dans le cœur en développement a été observée 24 heures après la fécondation. Le poisson zèbre adulte a eu la transmission germinale d’embryons fluorescents générés par sox17:EGFP-CAAX avec l’endoderme entièrement marqué avec EGFP-CAAX. La longueur antéro-postérieure de l’endoderme et la longueur dorso-ventrale de chaque poche des poches un à cinq ont été mesurées chez des embryons mutants BMP sauvages témoins et traités à l’éthanol.
La longueur totale de l’endoderme n’a pas été affectée par le génotype ou le traitement. Cependant, les poches un et trois ont montré des augmentations significatives de la longueur de la poche entre les embryons de type sauvage non traités et traités à l’éthanol, mais des diminutions significatives de la longueur entre les mutants BMP non traités et traités à l’éthanol. La poche deux a montré des augmentations significatives de la taille de la poche entre les groupes de type sauvage non traité et traité à l’éthanol et les groupes mutants BMP respectivement.
Lors de la tentative de cette procédure, il est essentiel d’être précis dans le pipetage et la dilution du système Tol2, ainsi que dans le fait de frapper le corps cellulaire pendant l’injection d’embryons.
