Cette méthode nous permettra d’isoler les particules du virus d’Epstein Barr de la lignée cellulaire P3HR1 et de quantifier le stock de virus afin qu’il puisse être utilisé à diverses fins de recherche. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une méthode relativement facile, peu coûteuse, rapide et fiable pour préparer un stock viral EB. Les particules vitales produites par cette technique peuvent être utilisées dans de nombreux modèles expérimentaux in vitro ou in vivo pour le diagnostic de EB.To commencer, préparer un volume de suspension cellulaire A dans un tube conique de 15 millilitres, ajuster le volume de telle sorte que le nombre de cellules soit d’environ 2,2 millions de cellules pour une plaque de culture de 100 millimètres.
Ajouter cinq millilitres de milieu de culture complet dans le tube. Ajouter 80 microlitres de diméthylsulfoxyde dans le tube. Ajoutez ensuite 350 microlitres d’un milligramme par millilitre de PMA au tube.
La concentration finale de PMA devrait être de 35 nanogrammes par millilitre, et celle de DMSO devrait être de 0,08%Ajouter 4,27 millilitres de milieu de culture de sorte que le volume total soit de 10 millilitres. Mélanger le contenu du tube en l’inclinant, puis transférer le contenu sur une plaque de culture de 100 millimètres. Laissez l’assiette dans un incubateur de culture cellulaire pendant cinq jours à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone.
Après cinq jours dans l’incubateur, centrifuger le contenu de la plaque à 120 G pendant huit minutes pour granuler les cellules Recueillir le virus acellulaire contenant du surnageant et jeter la pastille cellulaire. Encore une fois, centrifuger le surnageant à 16 000 G pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius pour enrober les particules virales. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille virale dans cinq millilitres de milieu de culture, Aliquote la suspension virale dans 20 tubes contenant chacun 250 microlitres de la suspension virale et stocker la suspension à moins 80 degrés Celsius.
Pour séparer les protéines de l’ADN, ajoutez 500 microlitres de phénol saturé en Tris à l’un des tubes contenant la préparation virale. Ajoutez bien 100 microlitres d’eau et de vortex pour obtenir une émulsion rose. Centrifuger pendant 15 minutes à 9 650 G, recueillir le surnageant et le transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.
Ajouter l’équivalent d’un dixième du volume surnageant d’acétate de sodium froid et mélanger en pipetant de haut en bas. Ajoutez ensuite un microlitre de 20 milligrammes par millilitre de glycogène, et mélangez par pipetage. Ajoutez trois fois le volume d’éthanol froid à 100% du surnageant et stockez-le à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.
Isoler la centrifugeuse d’ADN viral à 9, 650 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant pour obtenir une pastille d’ADN et lavez la pastille trois fois avec un millilitre d’éthanol froid à 70%. Encore une fois, centrifuger à 9, 650 G pendant 15 minutes et jeter le surnageant.
Après séchage à l’air de la pastille pendant environ 10 minutes, remettez la pastille en suspension dans 10 à 50 microlitres d’eau distillée sans nucléase. Entreposer les échantillons à moins 20 degrés Celsius pour un traitement ultérieur ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour assurer une dissolution maximale de l’ADN, suivie d’un stockage à moins 20 degrés Celsius. Après avoir nettoyé le piédestal d’un micro spectrophotomètre avec une tâche délicate, chargez un microlitre de l’échantillon d’ADN préparé et notez la concentration de l’ADN dans l’échantillon.
Vérifiez les rapports d’absorbance à la fois à 260 à 280 nanomètres et à 260 à 230 nanomètres. L’ADN absorbera à 260 nanomètres, les protéines à 280 nanomètres et les substances organiques telles que le phénol absorberont à 230 nanomètres. Un rapport de 1,8 à 2 est considéré comme suffisant pour la PCR en temps réel.
Pour préparer les mélanges réactionnels PCR, placez cinq microlitres d’un mélange PCR en temps réel cybervert dans des tubes PCR de 0,2 millilitre. Ajouter un microlitre de 7,5 pico moles par microlitre d’amorce avant et un microlitre de 7,5 pico moles par microlitre d’amorce inversée à chaque tube. Ici, le petit gène ARN 2 du VEB est amplifié.
Déterminer le nombre de copies du génome EBV. Ajoutez ensuite deux microlitres d’eau sans nucléase et un microlitre d’ADN viral à l’un des tubes. Le volume total du mélange réactionnel est de 10 microlitres.
Préparer d’autres tubes qui seront utilisés comme étalons avec des numéros de copie connus du génome du VEB. Exécutez les mélanges PCR en commençant par une étape initiale d’activation à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis 40 cycles à 95 degrés Celsius pendant 15 secondes, et à 58 degrés Celsius pendant 30 secondes.
Exportez toutes les feuilles de données sous forme de fichiers CSV et calculez le journal du nombre de copies du génome EBV par tube standard et les valeurs moyennes de CQ. Générer une courbe standard qPCR en traçant les valeurs CT des étalons par rapport au logarithme du nombre de copies du génome. En utilisant l’équation standard du tracé de courbe, dérivez le nombre de copies du génome EBV dans le tube de PCR contenant l’ADN viral induit.
Enfin, utilisez la formule affichée à l’écran pour calculer la concentration de la préparation virale induite. Ici, X est le nombre de copies du génome EBV dérivées de la courbe standard, et F est le facteur de dilution utilisé pour mettre en place l’ADN par réaction PCR. Le comptage cellulaire à l’aide d’une chambre hémocytométrique est montré ici.
Quatre quadrants sont comptés à l’aide d’un microscope optique. Ici, les cellules indiquées en bleu doivent être comptées, tandis que les cellules en rouge ne doivent pas être comptées, car elles touchent les bordures supérieure, droite, inférieure ou gauche du quadrant. Un essai d’optimisation a été effectué pour déterminer les concentrations de PMA et de diméthylsulfoxyde qui donneraient le plus grand nombre de particules EBV.
Une concentration de DMSO de 0,8% et une concentration de PMA de 35 nanogrammes par microlitre étaient optimales et ont entraîné des concentrations élevées d’EBV. Notre laboratoire a utilisé les particules vitales produites par cette technique pour examiner les réponses pro-auto-immunes ou inflammatoires à ce virus. Ainsi que de développer de nouveaux agents anti-EBV.
