Cette méthode de microscopie à fluorescence quantifie les phénotypes de salmonelles à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales de manière automatisée, permettant l’étude de la salmonelle sur un grand nombre de souches avec une résolution évolutive. Notre méthode a l’avantage d’être quantitative, à haut débit et automatisée en même temps, en s’appuyant à la fois sur une analyse de zone et une analyse unicellulaire. Le comportement intracellulaire est au cœur de l’interaction hôte-pathogène de nombreuses bactéries.
Notre méthode peut être facilement adaptée aux pathogènes bactériens autres que la salmonelle, contribuant ainsi à la compréhension de leur pathogenèse. Après avoir acquis les images, effectuez une analyse unicellulaire en ouvrant l’acquisition. czi dans ImageJ.
Divisez les canaux en cliquant sur l’image et en sélectionnant Couleur, puis Fractionner les canaux. Pour la segmentation des cellules, choisissez l’image du plan Z dans la fenêtre Titre d’acquisition C1. Sélectionnez la fenêtre Titre d’acquisition C1 et cliquez sur l’image suivie du doublon.
Ensuite, écrivez le numéro du plan Z choisi. Écrivez C1Zplane dans la zone de titre, décochez la case Pile Dupliquer et cliquez sur OK pour dupliquer uniquement l’image du plan Z sélectionnée. Une fenêtre appelée C1Zplane affichant l’image du plan Z sélectionnée s’ouvre.
Maintenant, améliorez le contraste de l’image C1Zplane obtenue en sélectionnant Traiter et en cliquant sur Améliorer le contraste. Ajustez les pixels saturés, cochez Normaliser, puis cliquez sur OK pour appliquer la technique d’amélioration du contraste afin d’obtenir une image C1Zplane normalisée par contraste. Accédez au processus et cliquez sur Rechercher des maxima pour segmenter les cellules épithéliales dans l’image C1Zplane normalisée par contraste.
Ensuite, pour attribuer un seul point maxima à chaque cellule épithéliale, marquez la sélection du point d’aperçu et définissez la tolérance au bruit. Pour obtenir l’image segmentée C1Zplane, une nouvelle image binaire de type masque qui affiche chaque particule segmentée par point maximal marqué, marquez les maxima d’arête Exclure, sélectionnez les particules segmentées comme Type de sortie, puis cliquez sur OK. Ensuite, créez un masque de cellules segmentées dans l’image segmentée C1Zplane. Cliquez sur Analyser, puis sur Analyser les particules, puis sélectionnez les options Afficher les masques et Exclure sur les bords.
Définissez l’intervalle de taille et cliquez sur OK pour obtenir le masque du masque binaire segmenté C1Zplane. Cliquez sur la table de choix et sélectionnez Inverser la table de choix dans la barre d’outils. Pour définir le seuil de l’image C1Zplane normalisée en termes de contraste, accédez à l’image, sélectionnez Ajuster, sélectionnez Seuil et vérifiez l’arrière-plan sombre.
Définissez le paramètre de seuil automatique sur la valeur par défaut et choisissez l’option rouge. Ajustez la valeur limite minimale jusqu’à ce que les cellules apparaissent complètement rouges, laissant un arrière-plan sombre. Cliquez sur Appliquer pour convertir l’image C1Zplane normalisée en une image binaire avec des cellules en blanc et l’arrière-plan en noir.
De plus, pour corriger la segmentation des cellules dans le masque du masque binaire segmenté C1Zplane, sélectionnez Traiter et cliquez sur Calculatrice d’images. Ensuite, sélectionnez le masque de C1Zplane segmenté en tant qu’image un, choisissez l’opération AND dans la liste déroulante, puis sélectionnez le C1Zplane normalisé par contraste seuillé comme image deux. Cliquez sur OK et ImageJ nommera automatiquement l’image de sortie comme résultats de Mask of C1Zplane Segmented.
Pour étiqueter chaque cellule segmentée de C1Zplane comme région d’intérêt, cliquez sur Analyser, puis sur Analyser les particules. Ajustez la taille comme indiqué précédemment et sélectionnez l’option Afficher Rien. Ajoutez toutes les particules à l’outil ROI Manager en cochant Ajouter au gestionnaire.
Cochez également la case Exclure sur les bords et cliquez sur OK. Enregistrez les données de retour sur investissement sous roi-cells-acquisitiontitle. parcourez le menu du gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Plus et en sélectionnant Enregistrer. Après avoir terminé la segmentation cellulaire, travaillez sur la fenêtre de titre d’acquisition C2 pour analyser les salmonelles vacuolaires.
Tout d’abord, allez dans le processus, cliquez sur le calculateur d’image, sélectionnez le titre d’acquisition C2 comme image un, et choisissez l’opération Soustraire dans la liste déroulante. Ensuite, sélectionnez le titre d’acquisition C3 comme image deux, cochez Créer une nouvelle fenêtre, puis cliquez sur OK. Appliquez une soustraction à l’ensemble de la pile Z en cliquant sur Oui dans la fenêtre Pile de processus. Dupliquez les résultats de la fenêtre de titre d’acquisition C2 en cliquant sur le menu Image et en sélectionnant Dupliquer.
Vérifiez ensuite la pile en double et appuyez sur OK pour obtenir les résultats de C2 acquisition title one window. Appliquez le flou gaussien aux résultats du titre d’acquisition C2 une fenêtre en accédant au processus, en cliquant sur le filtre et en sélectionnant le flou gaussien. Conservez la valeur Sigma comme deux ou personnalisez-la.
Cliquez sur OK et appliquez le flou gaussien à l’ensemble de la pile Z en cliquant sur Oui dans la fenêtre Traiter la pile. Soustrayez les résultats filtrés gaussiens du titre d’acquisition C2 un aux résultats du titre d’acquisition C2 en cliquant sur Processus et en sélectionnant le calculateur d’image. Sélectionnez maintenant les résultats du titre d’acquisition C2 comme image un, choisissez l’opération Soustraire dans la liste déroulante, sélectionnez les résultats du titre d’acquisition C2 un comme image deux, puis cliquez sur OK. Appliquez une soustraction à l’ensemble de la pile Z en cliquant sur Oui dans la fenêtre Pile de processus pour obtenir une fenêtre automatiquement nommée par ImageJ comme résultat des résultats du titre d’acquisition C2.
Pour séparer les salmonelles de l’arrière-plan des résultats des résultats du titre d’acquisition C2, cliquez sur l’image, sélectionnez Ajuster, puis cliquez sur le seuil. Ensuite, vérifiez l’arrière-plan sombre et définissez le seuil automatique sur Otsu. Ajustez la valeur seuil minimale jusqu’à ce que les salmonelles apparaissent complètement rouges, laissant un arrière-plan sombre.
Cliquez sur Appliquer et une fenêtre nommée Convertir en binaire s’ouvrira. Vérifiez le fond noir et cliquez sur OK. Sélectionnez le plan Z du milieu correspondant au plan focal des salmonelles intracellulaires dans les résultats de la fenêtre binaire des résultats de titre d’acquisition C2. Cliquez sur l’image suivie de Piles, puis sélectionnez Définir la tranche.
Maintenant, écrivez le numéro du plan Z de votre choix et cliquez sur OK. Ensuite, définissez les mesures à enregistrer pour chaque retour sur investissement en cliquant sur Analyser et en sélectionnant Définir la mesure. Ensuite, vérifiez la zone correspondant à la superficie totale de chaque ROI. Pour enregistrer la fraction de surface occupée par les pixels seuillés pour chaque retour sur investissement, cochez la case Fraction d’aire et Limite au seuil.
Vérifiez l’étiquette d’affichage pour étiqueter chaque retour sur investissement avec le titre de l’image, le canal, le plan Z et les coordonnées X/Y. Utilisez le plan Z choisi des salmonelles intracellulaires pour enregistrer les étiquettes, la superficie et le pourcentage de surface occupée par les salmonelles pour chaque cellule. Ouvrez le roi-cells-acquisitiontitle.
zip en cliquant sur le menu Fichier et en sélectionnant Ouvrir. Ensuite, cliquez sur Mesure dans le menu ROI Manager. Le résultat est un tableau rapportant les mesures sélectionnées.
Enfin, enregistrez la table des résultats en sélectionnant le fichier et en cliquant sur Enregistrer sous dans la fenêtre de résultats. L’invasion cellulaire, la charge vacuolaire et l’hyper-réplication cytosolique de la salmonelle ont été visualisées à l’intérieur des cellules épithéliales. L’analyse de la zone a révélé un rapport d’infection significativement plus élevé chez Salmonella typhimurium par rapport aux deux souches de Salmonella derby, démontrant l’efficacité de l’analyse de surface pour détecter les différences dans la capacité des souches de salmonelles à coloniser les cellules épithéliales.
La souche mutante supprimée par Salmonella derby sipA a montré un rapport d’hyper-réplication réduit par rapport à la souche sauvage de Salmonella derby, ce qui correspond au rôle de sipA dans l’induction de l’hyper-réplication. Aucune différence d’hyper-réplication n’a été observée entre Salmonella typhimurium et Salmonella derby de type sauvage. L’analyse unicellulaire n’a montré aucune différence significative dans le pourcentage de cellules infectées dans les souches de Salmonella derby par rapport à Salmonella typhimurium.
Sinon, les souches de Salmonella derby ont généré une charge vacuolaire moyenne significativement inférieure à celle de Salmonella typhimurium. Aucune différence n’a été observée entre Salmonella typhimurium et Salmonella derby de type sauvage, tandis que Salmonella derby sipA a montré une diminution significative de l’hyper-réplication, conformément au résultat de l’analyse de la zone. Salmonella comprend plusieurs sérovars à virulence diverse.
L’étude d’un grand nombre de souches par cette méthode rapide et automatisée contribue de manière significative à la compréhension du potentiel de virulence réel de cet agent pathogène.
