Il s’agit du premier rapport démontrant que l’injection intramyocardique percutanée de cardiomyocytes guidée par échocardiographie améliore significativement la propriété réparatrice des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPS. Cette méthode est une procédure réalisable, satisfaisante, reproductible, moins invasive et efficace pour administrer un traitement des cardiomyocytes dérivés des iPS humaines. Nous croyons que l’administration intramyocardique percutanée est une méthode sûre et efficace pour l’administration locale de médicaments pour des maladies telles que les cardiopathies ischémiques, l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque.
Ce projet est supervisé par le professeur Jinfu Yang et le professeur Jun Peng. Xun Wu, Kele Qin et Kun Xiang, MD PhDs de mon laboratoire et Di Wang, un PhD du Laboratoire provincial de recherche cardiovasculaire du Hunan. Pour commencer, aspirez le surnageant de culture à partir d’une culture de 60 jours de hiPSC-CM.
Lavez les cellules avec PBS trois fois. Ensuite, dissocier les hiPSC-CM en cellules individuelles en utilisant le mélange d’enzymes de détachement cellulaire à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu RPMI plus B27 et mélanger.
Comptez les cellules et calculez le nombre total de cellules. Centrifuger la suspension cellulaire à 300G pendant deux minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans le milieu de support des cardiomyocytes à une concentration de 6 x 10 des 4e cellules par microlitre.
Placez le tube à 37 degrés Celsius jusqu’à l’étape d’injection. Une fois que la souris est suffisamment anesthésiée, fixez les membres et la queue avec du ruban adhésif. Ensuite, fixez les incisives de la souris avec un fil de soie 2/0 et du ruban adhésif.
Stérilisez le cou médian et la poitrine gauche avec trois cycles alternés de bétaïne suivis d’alcool. Faites une incision médiane du cou à l’aide de fins ciseaux anatomiques et de pinces à dissection fine. Coupez quelques muscles cervicaux antérieurs pour stabiliser et exposer complètement la trachée.
Insérez une aiguille de ponction de cathéter de calibre 20 comme tube trachéal dans la bouche. Connectez le tube trachéal au ventilateur et vérifiez les mouvements thoraciques pour vous assurer que les deux poumons sont bien ventilés. Ajustez les paramètres respiratoires.
Ensuite, refixez le membre postérieur gauche sur le côté inférieur droit et desserrez le ruban autour du membre supérieur gauche. Avec des ciseaux et des pinces à dissection fine, effectuez une thoracotomie à l’espace intercostal de trois à quatre du thorax gauche. À l’aide d’une pince, décollez le péricarde et localisez l’artère coronaire descendante antérieure gauche.
Utilisez un fil de soie 6/0 pour ligaturer l’extrémité proximale de l’artère. Pour s’assurer que le modèle d’infarctus aigu du myocarde est établi, attendez que le côté distal de l’artère au site de ligature passe du rouge au blanc. Fermez la poitrine couche par couche et suturez la peau avec un fil 4/0.
Pour le groupe d’animaux fictifs, effectuez toutes les interventions chirurgicales à l’exception de la ligature. Au cours des deux premières semaines suivant l’infarctus du myocarde, placez les souris dans une boîte d’anesthésie reliée à 5% d’isofluorane et effectuez une intubation trachéale. Trois jours avant d’administrer des CM-HIPSC, injecter de la cyclosporine A dans la cavité intrapéritonéale à une dose de 10 milligrammes par kilogramme et par jour.
Enlevez les poils de la poitrine et du haut de l’abdomen de la souris avec une crème dépilatoire. Fournir de l’isofluorane par inhalation jusqu’à ce que la fréquence cardiaque soit maintenue à 400 à 500 battements par minute. Fixez les membres et la queue de la souris avec du ruban adhésif sur la console de détection et réglez la température de la plate-forme à 37 degrés Celsius.
Appliquez la gelée à ultrasons sur le haut de l’abdomen. À l’aide d’une sonde à ultrasons vétérinaires à haute résolution, obtenir des images du foie de souris. À l’aide d’une micro-seringue de cinq microlitres, prélever environ 3 x 10 sur le 5e hiPSC-CM.
Tenez la seringue et insérez une aiguille de trois millimètres au processus paraxiphoïde gauche. Sous guidage échographique, suivez le bord supérieur du diaphragme. Observez le rythme respiratoire et la portée.
Entrez dans le péricarde à la fin du cercle expiratoire, en évitant d’endommager le foie et les poumons. Acquérir ensuite l’image parasternale à axe long du cœur de souris par échocardiographie en mode B. Sous guidage ultrasonique, injecter 1 x 10 à la 5ème cellule hiPSC-CMs dans chacune des trois zones marginales du site de l’infarctus.
Retirez la sonde à ultrasons et rincez la gelée. Sevrez la souris de l’anesthésie et remettez-la dans sa cage. Injecter la cyclosporine A en continu pendant un mois après la transplantation.
L’échocardiogramme du ventricule gauche a montré que les blessures dues à l’infarctus du myocarde étaient inversées dans le groupe à doses multiples. La transplantation de hiPSC-CM a également entraîné une augmentation de la fraction d’éjection et du raccourcissement de la fraction. La mesure des paramètres cardiaques à l’aide de la coloration rouge Sirius et verte rapide a montré que la taille de l’infarctus et la fraction volumique du collagène diminuaient, tandis que l’épaisseur de la paroi antérieure ventriculaire gauche augmentait après la transplantation.
L’étiquetage de l’actine alpha non spécifique en vert, du DAPI en bleu et de la troponine T spécifique à l’homme en rouge a montré la présence de cellules transplantées dans l’infarctus et la zone marginale de l’infarctus. Le nombre et le pourcentage de cellules transplantées étaient plus élevés dans le groupe à doses multiples que dans le groupe à dose unique. 28 jours après l’infarctus du myocarde, le groupe à doses multiples a montré une augmentation du nombre de cellules exprimant le marqueur des cellules endothéliales, I-B4.
L’agglutinine de germe de blé et la coloration à l’alpha-actinine sarcomérique sur les cardiomyocytes ont montré une réduction du diamètre minimum des fibres. Un nombre plus faible de noyaux de cardiomyocytes à tunnel positif dans le groupe à doses multiples indiquait une réduction de l’apoptose. L’analyse PCR a détecté l’ADN mitochondrial humain uniquement dans le cœur, montrant une transplantation spécifique.
Lors de l’insertion de l’aiguille, assurez-vous qu’elle pénètre dans la cavité péricardique avec la marge supérieure du diaphragme et à la fin du cercle expiratoire pour éviter les blessures au foie ou aux poumons.
