Ce protocole présente comment créer un modèle de gangrène de coussinet plantaire de souris en utilisant l’administration d’inhibiteur de masse et de coagulation de l’artère fémorale. La perfusion DiI permet alors une visualisation à haute résolution du système vasculaire du coussinet plantaire. Ce modèle est cliniquement pertinent et peut être utilisé pour les tests précliniques de drogues et pour étudier l’ischémie des membres.
La visualisation à haute résolution du système vasculaire offre un moyen techniquement facile d’évaluer la néovascularisation. Ce modèle de gangrène du coussinet plantaire a des applications importantes dans la recherche préclinique sur les maladies artérielles périphériques et l’ischémie critique des membres. La perfusion DiI est un outil utile pour étudier la néovascularisation dans des modèles animaux.
Antoine Ribieras, résident en chirurgie, et Yulexi Ortiz, associé de recherche de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Tout d’abord, fabriquez la solution de travail DiI en ajoutant 200 microlitres de solution mère DiI à 10 millilitres de la solution diluante de travail immédiatement avant utilisation. Serrez à la main pour bien mélanger.
Connectez deux ou trois robinets d’arrêt à trois voies et une aiguille papillon de calibre 25 en série. Préparez des seringues de 10 millilitres avec quatre millilitres de PBS, 10 millilitres de solution de DiI et 10 millilitres de formol tamponné neutre à 10%. Connectez la seringue avec du formol à l’orifice d’entrée proximal et injectez la solution pour évacuer l’air de la ligne.
Tournez ensuite le robinet d’arrêt pour fermer le port. Répétez la même procédure, en connectant les seringues avec DiI puis PBS aux orifices d’entrée du milieu et du distum respectivement. Après l’euthanasie, placez l’animal en position couchée sur un coussin absorbant et fixez les aisselles et les membres inférieurs avec des aiguilles.
À l’aide de ciseaux, faites une incision transversale pour ouvrir la cavité abdominale, puis exposez et divisez le diaphragme gauche et droit pour accéder à la cavité thoracique. Coupez la paroi thoracique de chaque côté du sternum, des côtes inférieures aux première ou deuxième côtes. Utilisez un hémostat pour saisir l’extrémité inférieure du sternum et le réfléchir vers la tête de l’animal pour exposer la cavité thoracique.
Identifiez le ventricule gauche, qui semble de couleur plus claire que le droit. Saisissez doucement le cœur avec une pince émoussée et insérez l’aiguille papillon dans le ventricule gauche. Utilisez des ciseaux ou une aiguille de calibre 18 pour percer l’oreillette droite, permettant ainsi au sang et aux solutions de perfusion de retourner au cœur pour s’écouler.
Ouvrez le port de la seringue avec pbS et injectez manuellement deux à quatre millilitres à raison d’un à deux millilitres par minute pendant une à deux minutes pour éliminer le sang du système vasculaire. Assurer une perfusion réussie en observant les saignements de l’oreillette droite. Après l’injection, fermez l’orifice de la seringue PBS.
Ouvrez le orifice de la seringue avec DiI et injectez cinq à 10 millilitres à raison de un à deux millilitres par minute pendant cinq minutes. Après l’injection, fermez l’orifice de la seringue DiI et attendez deux minutes pour permettre l’incorporation du colorant avant l’injection de fixateur. Ouvrez le orifice de la seringue avec du formol et injectez cinq à 10 millilitres à raison de un à deux millilitres par minute pendant cinq minutes.
Après l’injection, retirez l’aiguille du ventricule gauche. À l’aide de ciseaux lourds, disloquez le tibia à la cheville, en séparant complètement les pieds gauche et droit du bas des jambes. Placer les pieds récoltés dans une plaque de 12 puits avec un à deux millilitres de solution de formol à 10%.
Enveloppez l’assiette avec du papier d’aluminium et conservez-la à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez la solution fixatrice dans une plaque de 12 puits par un à deux millilitres de PBS par puits. Faites une incision longitudinale avec un scalpel sur la partie plantaire et dorsale du pied.
Ensuite, à l’aide de pinces dentées et d’un petit hémostat, retirez soigneusement toute la peau du pied et des doigts, sans endommager les tissus mous sous-jacents. Pour monter les tissus, placez individuellement les pieds entre deux lames de microscope en verre avec un tampon de biopsie en mousse plié sur lui-même à chaque extrémité. Utilisez deux petits clips de liant pour comprimer les lames de verre ensemble à chaque extrémité.
Alternativement, retournez le coussinet de pied à une plaque de 12 puits avec un à deux millilitres de PBS. Après l’avoir recouvert de papier d’aluminium, conservez-le à quatre degrés Celsius pour maintenir la fluorescence jusqu’à un mois. Allumez le système d’imagerie, démarrez le logiciel d’acquisition et utilisez un objectif à faible grossissement ou à faible ouverture numérique pour capturer des images.
Cliquez sur oui dans la boîte de dialogue Activer la scène. Activez le laser de 561 nanomètres dans l’onglet de configuration. Sur l’écran principal, activez un tracé de faisceau visible en cliquant sur le bouton visible.
Réglez un détecteur sur la plage de 570 à 600 nanomètres en cliquant sur la case active correspondante. Sélectionnez l’icône de balayage par vignette dans l’onglet Acquisition et définissez la résolution souhaitée. Positionnez l’échantillon de tissu sec monté comprimé entre les lames de verre sur la scène du microscope et mettez le tissu au point.
Accédez à un coin de l’exemple. Sous le menu de balayage des tuiles, cliquez sur le bouton de position de la marque. Naviguez jusqu’au coin opposé et cliquez à nouveau sur le bouton de position de la marque pour définir les limites de numérisation.
Pour définir la profondeur de la pile Z, cliquez sur le bouton en direct. Accédez au centre de l’échantillon et utilisez le bouton de l’axe Z pour faire défiler jusqu’au bas de l’échantillon. Dans l’onglet acquisition sous le menu Z-stack, cliquez sur le bouton commencer.
Faites défiler jusqu’en haut de l’échantillon et cliquez sur le bouton de fin. Cliquez sur la taille z-step et réglez sur la valeur souhaitée. Cliquez ensuite sur Démarrer pour commencer l’acquisition d’images.
La figure montre la variation de la perte tissulaire que l’on peut attendre de ce modèle une semaine après la chirurgie avec des scores FABER enregistrés dans le coin inférieur droit de chaque image. Les images de microscopie de reconstruction révèlent une anatomie vasculaire normale dans le coussinet du pied témoin non ligaturé par rapport à une perfusion sévèrement diminuée au coussinet plantaire du membre postérieur ligaturé cinq jours après la chirurgie. 20 jours après la chirurgie, la perfusion au coussinet du pied s’est considérablement améliorée, mais pas dans la mesure d’un contrôle non ligaturé.
La vidéo montre que le rendu de surface a ensuite été créé à l’aide de la fonctionnalité d’animation. Rincez toutes les bulles d’air de l’ensemble de perfusion. Si les poumons se dilatent et deviennent roses pendant la perfusion, l’aiguille a pénétré dans le ventricule droit et doit être légèrement rétractée.
Les tissus des membres peuvent être utilisés pour l’immunocoloration afin d’évaluer la nécrose musculaire, la régénération tissulaire, la densité des vaisseaux et le recrutement des cellules progénitrices et d’autres cellules de réparation tissulaire. La technique de perfusion DiI dans ce modèle de gangrène murine a été utilisée dans des études de thérapies géniques et cellulaires. La recherche vise à améliorer la perfusion dans les membres des patients atteints d’ischémie critique des membres.
