Les membres recombinants sont un modèle puissant pour une étude dans le processus de différenciation cellulaire et de formation de puissance sous l’influence de signaux embryonnaires dans un environnement in vivo. Ce test permet de multiples variations permettant des applications potentielles sans se limiter à la biologie du développement des membres du poulet. Il peut être appliqué à d’autres tiges ou progéniteurs d’autres organismes.
Pour commencer, retirez les œufs de l’incubateur après trois jours et demi, écouvillonnez avec de l’éthanol à 70% et laissez-les sécher à l’air. Ensuite, identifiez et localisez les embryons en développement en candling l’œuf et en observant les vaisseaux sanguins. Jetez les œufs qui n’ont pas d’embryon.
Tapotez l’extrémité émoussée de la coquille d’œuf avec l’extrémité d’une paire de pinces émoussées pour ouvrir une fenêtre et retirez environ un centimètre carré de la coquille à l’aide de la pince. Ensuite, transférez les œufs dans un support en plastique ou en carton. Placez les œufs un par un sous le stéréomicroscope.
Identifiez la membrane d’air et retirez-la en faisant un petit trou dans la zone sans vaisseaux. Retirez cette zone à l’aide de fines pinces chirurgicales et retirez les morceaux de coquille d’œuf en contact avec l’embryon. Déchirez le sac amniotique avec une pince chirurgicale fine.
Retirez soigneusement l’embryon de l’œuf avec une pince émoussée et transférez-le dans une boîte de Petri stérile contenant 1x PBS glacé. Lavez les embryons une fois dans 1x PBS glacé et retirez toutes les membranes restantes sous le stéréomicroscope. Ensuite, localisez les bourgeons des membres postérieurs.
Coupez chaque bourgeon du membre postérieur longitudinalement, en coupant très près du flanc de l’embryon avec de fines pinces chirurgicales. Maintien des embryons dans 1x PBS. Ensuite, transférez les bourgeons des membres dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec une pipette de transfert en plastique.
Ensuite, remplacez le PBS par 500 microlitres de solution de trypsine à 0,5%. Incuber les bourgeons des membres dans un thermobloc pendant sept minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, remplacez la solution de trypsine par 500 microlitres de deux milligrammes par millilitre de collagénase de type quatre dans HBSS et incubez-la dans le thermobloc pendant huit minutes supplémentaires.
Retirez autant de collagénase que possible et remplacez-la par un millilitre de DMEM froid à haute teneur en glucose avec 10% de FBS pour inactiver les enzymes. Pipettez doucement le mélange environ 10 fois. Filtrer la suspension contenant les cellules avec une passoire cellulaire de 70 micromètres pour laisser derrière elles les ectodermes.
Pipetter à nouveau la suspension environ cinq à 10 fois et centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant. Lavez l’excès de collagénase avec un millilitre de milieu, puis centrifugez la suspension et jetez soigneusement le milieu.
Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de milieu sans perturber les cellules et incubez-les pendant une à 1,5 heure à 37 degrés Celsius dans un thermobloc, permettant aux cellules de former une pastille compacte. Après avoir obtenu les bourgeons des membres postérieurs, transférez-les dans un tube de microcentrifugation vide avec une pipette en plastique. Retirez tout excès de 1x PBS et remplacez-le par 500 microlitres de 0,5% de trypsine dans 1x PBS stérile.
Incuber le mélange pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un thermobloc. Transférer la solution de trypsine avec les bourgeons des membres dans une boîte de Petri stérile. Ensuite, retirez autant que possible l’excès de trypsine et inondez la boîte de Petri avec 1x PBS glacé avec 10% FBS jusqu’à ce que tous les bourgeons des membres soient couverts.
Identifiez les bourgeons des membres sous le stéréomicroscope. Ensuite, identifiez l’ectoderme comme une membrane transparente légèrement détachée des cellules mésodermiques des membres. Détachez et séparez l’ectoderme avec une pince tenant l’extrémité la plus proximale du bourgeon du membre avec une pince chirurgicale fine.
Prenez la pastille mésodermique des étapes précédentes et jetez environ 600 microlitres du milieu. Ensuite, détachez soigneusement la pastille avec une pointe de pipette sans la briser. Tournez le tube à l’envers pour transférer la pastille dans la boîte de Petri contenant les ectodermes vides.
Coupez un petit morceau de la pastille avec une paire de pinces chirurgicales fines et placez-le le plus près possible de l’ectoderme. Ouvrez l’ectoderme avec la pince chirurgicale et placez la pastille aussi étroitement que possible dans la salle ectodermique. Ouvrez le sac amniotique près du membre antérieur pour exposer le flanc droit de l’embryon.
Guidé par la position du membre antérieur, effectuez le grattage de la plaie avec une aiguille en tungstène de la longueur de deux à trois somites, endommageant légèrement le mésoderme jusqu’à ce qu’il saigne. Transférer individuellement les membres recombinants dans l’embryon de poussin, en plaçant sa base sur une plaie de somite. Fixez correctement le membre recombinant avec deux morceaux de fil de palladium.
Alignez la base du membre recombinant avec la plaie. Scellez la fenêtre avec du ruban adhésif et retournez l’œuf à l’incubateur. Lors d’une implantation réussie, le membre recombinant a été observé comme une protubérance solidement attachée à la paroi mésodermique de l’embryon donneur.
Au contraire, le membre recombinant a été détaché de la paroi mésodermique ou a présenté une morphologie rugueuse lorsque la viabilité cellulaire ou le greffon a échoué. La coloration bleu Alcian a démontré des éléments squelettiques dans un membre recombinant de poulet de six jours. Avant d’éliminer le bleu d’Alcian, des images dans l’éthanol ont été obtenues pour des mesures morphologiques et quantitatives.
Les membres colorés ou non colorés de H & E ont été tranchés pour observer les tissus et les cellules. Cette technique permet de développer des organoïdes de membres in vivo et d’étudier la différenciation cellulaire ou le processus morphogénétique en utilisant les cellules souches de différentes sources ou espèces.
