Ce protocole utilise l’automatisation pour effectuer des préparations de biochimie des protéines avant les expériences de spectrométrie de masse, permettant un débit plus élevé et une variabilité plus faible pour les études protéomiques. Ce protocole utilise un système de manipulation de liquide programmable à faible coût qui est abordable pour un plus grand nombre de laboratoires. Nous fournissons des scripts Python open source qui peuvent être modifiés pour un développement ultérieur.
Milton Amaya, étudiant à la maîtrise dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, ouvrez le noSP3_Digestion. py script dans l’éditeur de texte et spécifiez les variables spécifiques à l’expérience si nécessaire dans la section PERSONNALISER ICI UNIQUEMENT.
Ensuite, ouvrez l’application Opentrons et téléchargez le script dans l’onglet Protocole de l’application Opentrons. Ensuite, placez le matériel de laboratoire et les pipettes requis à l’emplacement correspondant dans le deck OT2 spécifié dans le script Python. Ensuite, placez la solution de bicarbonate d’ammonium dans le puits A1 du rack à tubes quatre en un avec le support de tube de 15 millilitres plus 50 millilitres et placez l’échantillon de protéines dans le puits A1 du rack de tubes quatre en un avec un support de tube de deux millilitres.
Placez manuellement des tubes à faible liaison de protéines de deux millilitres dans les puits du bloc d’aluminium placé au-dessus du module de température, à partir de A1 et en descendant verticalement. Ensuite, placez la solution TNT dans le puits A6 du rack à tubes quatre en un avec un support de tube de deux millilitres. Observez pendant que le robot transfère un volume approprié du tampon de bicarbonate d’ammonium aux tubes d’échantillonnage dans le bloc d’aluminium.
Ensuite, vérifiez manuellement que le programme du robot est mis en pause et affiche le message, Assurez-vous que la TNT a été chargée dans A6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant de reprendre le protocole. Après avoir confirmé l’emplacement du tube TNT et ouvert le capuchon du tube, cliquez sur le bouton Reprendre dans l’application Opentrons pour continuer. Assurez-vous que le robot transfère 10 microlitres de la solution TNT à chaque puits d’échantillonnage, suivi de cinq tours de mélange.
Ensuite, vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message, Assurez-vous de fermer les bouchons sur les tubes d’échantillonnage. Ensuite, fermez manuellement les capuchons des tubes et cliquez sur Reprendre pour continuer. Attendez que le module de température du robot commence à chauffer le bloc d’aluminium et que la température atteigne 55 degrés Celsius, suivie d’une incubation de cinq minutes pour permettre aux échantillons d’atteindre 55 degrés Celsius.
Le robot maintiendra ensuite cette température pendant 30 minutes pour permettre la réduction des protéines par TNT. Pendant l’incubation, préparez une solution d’iodoacétamide et enveloppez-la manuellement avec du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière. Après l’incubation, lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message d’avertissement, assurez-vous d’ouvrir les bouchons sur les tubes d’échantillonnage, décapsulez les tubes d’échantillonnage et cliquez sur Reprendre pour continuer.
Ensuite, vérifiez manuellement que le programme du robot est mis en pause avec le message d’avertissement, Assurez-vous que l’iodoacétamide a été chargé dans B6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant de reprendre le protocole. Après avoir confirmé l’emplacement du rack du tube d’iodoacétamide et ouvert le capuchon du tube, cliquez sur Reprendre et assurez-vous que le robot transfère 10 microlitres de la solution d’iodoacétamide à chaque tube d’échantillonnage, suivi de cinq tours de mélange. Lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message, fermez les bouchons sur les tubes d’échantillonnage, recouvrez les tubes d’échantillonnage et recouvrez-les de papier d’aluminium, puis couvrez tout le bloc d’aluminium avec un morceau de papier d’aluminium propre et cliquez sur Reprendre pour continuer.
Attendez que les échantillons soient incubés à 22 degrés Celsius pendant 30 minutes et assurez-vous que le module de température du robot se désactive à la fin de l’incubation de l’iodoacétamide. Lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message d’avertissement, Assurez-vous que la trypsine a été chargée dans C6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans la fente quatre avant la reprise du protocole, placez la solution de trypsine dans le puits C6 du rack de tubes de deux millilitres avec le capuchon du tube ouvert, puis cliquez sur Reprendre pour continuer. Ensuite, lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message d’avertissement, Ouvrez les bouchons sur les tubes d’échantillonnage sur le module de température, décapsulez les tubes d’échantillon et cliquez sur Reprendre pour continuer.
Veille pendant que le robot transfère 10 microlitres de trypsine à chaque tube d’échantillonnage, suivi de cinq tours de mélange. Après la digestion de la trypsine pendant la nuit, faites tourner brièvement les échantillons à l’aide d’une microcentrifugeuse de paillasse et placez les échantillons sur un support à tubes magnétiques. Après deux minutes, transférer soigneusement le surnageant avec une pipette dans un nouvel ensemble de tubes de microcentrifugation à faible liaison de protéines et conserver les échantillons au réfrigérateur.
Ensuite, ouvrez le SP3_peptide_cleanup. py Python script dans un éditeur de texte, et spécifiez les variables d’expérience si nécessaire dans la section PERSONNALISER ICI UNIQUEMENT. Ensuite, téléchargez le script dans l’onglet Protocole de l’application Opentrons.
Placez le matériel de laboratoire et les pipettes requis à l’emplacement correspondant dans le deck OT2 spécifié dans le script Python et assurez-vous que le module magnétique est allumé et connecté au robot. Placez une nouvelle plaque de puits de deux millilitres et de 96 puits de profondeur sur le dessus du module magnétique. Ensuite, placez les échantillons digérés dans le rack de tubes de deux millilitres à partir de A1 et en descendant verticalement.
Ensuite, assurez-vous que le robot transfère 55 microlitres des échantillons digérés aux puits dans les plaques de puits profondes sur le module magnétique. Vérifiez que le protocole du robot est mis en pause et affiche le message , Assurez-vous que les billes préparées ont été chargées dans A6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant de reprendre le protocole. Ensuite, vortex et faites tourner brièvement les billes SP3 dans une mini centrifugeuse de paillasse et placez-les dans le puits A6 du rack à tubes de deux millilitres avec le capuchon ouvert.
Vérifiez que le programme des robots est en pause et affiche le message , Assurez-vous que 80% d’éthanol a été chargé dans A4 du rack de tubes de 15 millilitres plus 50 millilitres situé dans l’emplacement cinq avant la reprise du protocole. Ensuite, placez une solution d’éthanol à 80% dans le puits A4 dans le rack à tubes et cliquez sur Reprendre pour continuer. Observez pendant que le robot modifie la vitesse de pipetage pour ralentir, aspire le surnageant de chaque puits et le distribue dans le tube à déchets.
Attendez que le robot rétablisse la vitesse de pipetage par défaut et désengage le module magnétique. Lorsque le programme des robots est mis en pause et affiche le message, Ouvrez le capuchon sur le tube de bicarbonate d’ammonium, ouvrez le bouchon de la solution de bicarbonate d’ammonium, puis cliquez sur Reprendre pour continuer. En veille pendant que le robot désengage le module magnétique, transfère 250 microlitres du tampon de bicarbonate d’ammonium à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois.
Ensuite, observez pendant que le robot modifie la vitesse de pipetage pour ralentir et transfère le surnageant de chaque puits au tube de déchets. Attendez que le robot transfère 100 microlitres du tampon de bicarbonate d’ammonium à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois. Vérifiez que le programme des robots est mis en pause et affiche le message, Assurez-vous que de nouveaux tubes de collecte ont été placés dans le bloc d’aluminium de deux millilitres avant de reprendre le protocole.
Ensuite, placez un nouvel ensemble de tubes de microcentrifugation à faible rétention de protéines dans le bloc d’aluminium immédiatement après le dernier tube d’échantillon initialement dans le bloc, puis cliquez sur Reprendre pour continuer. Veille pendant que le robot transfère chaque échantillon dans le tampon de bicarbonate d’ammonium vers les nouveaux tubes de deux millilitres. Lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message, Assurez-vous que la trypsine a été chargée dans C6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant la reprise du protocole, placez la solution de trypsine dans le puits C6 du rack de tubes de deux millilitres avec le capuchon du tube ouvert, puis cliquez sur Reprendre pour continuer.
Une fois le programme terminé, enveloppez les bouchons du tube d’échantillonnage avec un film de paraffine, transférez tous les échantillons dans un mélangeur à température contrôlée et incubez à 37 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures avec des secousses à 1 000 tr / min. Avec l’échantillon BSA, un milieu de 728 correspondances de spectre peptidique et 65 peptides ont été identifiés, avec des coefficients de variation de 5,2% et 3,2%, respectivement. Avec un échantillon cardiaque complexe, un milieu de 9 526 correspondances de spectre peptidique, 7 558 peptides et 1 336 protéines a été identifié en 10 séries avec des coefficients de variation de 7,6%, 5,9% et 3,6%, respectivement.
Pour déterminer la variabilité de la quantification peptidique, les coefficients de variation des intensités du chromatogramme ionique extrait ont été calculés pour 10 peptides qui correspondent à une protéine unique. Lorsque les variabilités des résultats expérimentaux humains par rapport aux résultats expérimentaux du robot dans la mesure de la concentration en protéines ont été comparées au test BCA, le coefficient de variation moyen du test BCA robotisé était inférieur au test BCA manuel humain. Ce protocole réduit le temps de banc pour le traitement de chaque échantillon.
Cela nous ouvre la voie pour explorer les différences protéomiques dans un panel de lignées cellulaires entre plusieurs traitements médicamenteux.
