L’objectif global de cette procédure est de démontrer des méthodes de dissection pour la jambe adulte de la drosophile. Cette technique enlève une partie de la cuticule, exposant le tissu sous-jacent d’une manière qui préserve l’architecture neuronale et musculaire. Cette procédure nous permet de caractériser la jonction neuromusculaire pour les tonnelles de motoneurones identifiées, en utilisant des techniques chimiques immunocytaires standard.
La dissection est particulièrement utile pour l’étude des changements dégénératifs lents qui se produisent sur des périodes relativement longues. L’aspect temporel est une considération importante, car la jonction neuromusculaire bien caractérisée des larves de drosophiles est stable pendant environ cinq à sept jours avant le début de la métamorphose. Inversement, les neurones adultes sont présents tout au long de la vie d’une mouche adulte, environ 90 jours pour une drosophile mélanogastre de type sauvage élevée en laboratoire.
La technique est flexible et peut être appliquée à une gamme de génotypes pour différents modèles de maladie, et utiliser une gamme d’anticorps disponibles pour la drosophile comme système modèle. L’objectif global de cette procédure est de démontrer des méthodes de dissection pour la jambe adulte de la drosophile. Cette technique enlève une partie de la cuticule, exposant le tissu sous-jacent d’une manière qui préserve l’architecture neuronale et musculaire.
À l’aide d’un pinceau, transférer les mouches au méthanol froid dans un puits ou un plat en verre pendant environ 30 secondes à une minute. Le méthanol solubilise les hydrocarbures cuticulaires et les mouches peuvent maintenant être immergées plutôt que de flotter dans des solutions aqueuses. Avec les pinces, transférez soigneusement les mouches sur PBS.
Rincez trois fois dans du PBS glacé pour éliminer l’excès de méthanol et gardez les mouches dans le PBS sur la glace jusqu’à la dissection et la fixation. À ce stade, les mouches doivent être disséquées et fixées dans les plus brefs délais, de préférence moins de 30 minutes. Transférer les mouches dans un plat de dissection en élastomère de silicone rempli de PBS froid.
Retirez les jambes métathoraciques à la coxa à l’aide de deux paires de pinces Dumont numéro cinq, ou coupez les jambes avec des ciseaux Vannas. Transférez les jambes dans un puits dans une plaque de 24 puits en plastique remplie d’un mil de PBS et gardez la plaque sur la glace jusqu’à ce que toutes les jambes soient retirées et transférées dans des puits. Nous utilisons généralement 20 jambes par puits.
Remplacez la solution PBS par une solution FA millilitre et faites pivoter sur un nutateur pendant 30 minutes. Le réglage du nutateur doit être réglé à une vitesse moyenne. Assurez-vous que les jambes sont complètement immergées dans la solution pendant ce temps.
Pour éliminer la solution de FA, lavez un mil PBS trois fois rapidement, suivi de trois lavages supplémentaires pendant cinq minutes chacun dans un mil PBS. Tenez les tissus dans un mil PBS sur de la glace, avant et pendant les étapes de dissection. Pour donner un bref aperçu de l’anatomie de la jambe de la drosophile, les segments de la jambe sont indiqués, y compris la coxa, le trochanter, le fémur, le tibia et cinq segments du tarse.
Ici, nous voyons une vue antérieure de la jambe, reconnue par la présence de poils sensoriels par opposition à la cuticule nue présente sur le côté postérieur. L’orientation de l’axe proximal-distal et de l’axe dorsal-ventral est également indiquée. Cette procédure de dissection enlève un petit morceau de cuticule du fémur proximal, de sorte que les tonnelles axonales, qui projettent dorsalement, innervant le muscle releveur du tibia, peuvent être étudiées.
Nos travaux antérieurs se sont concentrés sur la tonnelle indiquée, provenant de la lignée oculaire présomptive des neuroblastes. Dans cette partie de la procédure, nous enlevons la cuticule de la face antérieure du fémur. Les pinces disséquantes sont essentielles au succès, et nous avons constaté que l’introduction d’une légère courbure à l’extrémité du numéro cinq des pinces super fines fournit un biseau qui permet à la cuticule d’être saisie superficiellement, plutôt que d’être piquée, ce qui peut ruiner le tissu.
Transférer les jambes dans un plat en élastomère de silicone dans PBS pour la dissection. À l’aide d’une paire de pinces, épinglez le segment du tibia au plat en élastomère de silicone comme indiqué ici sur le côté droit. À l’aide des autres pinces maintenues du côté biseauté vers le bas, attrapez un morceau de cuticule à l’extrémité distale du fémur et tirez dans la direction proximale vers le trochanter.
Continuez à enlever méthodiquement la cuticule jusqu’à ce que le muscle nu soit visible dans toute l’extrémité proximale du fémur. Une fois que toutes les jambes sont disséquées, remplacez PBS par une solution de FA pour postfixer les jambes pendant 30 minutes en secouant sur un nutateur à vitesse moyenne. Ensuite, lavez les échantillons dans un mil PBS pendant trois fois rapidement, puis trois fois pendant cinq minutes chacun dans une solution PBT.
Pour bloquer les tissus, remplacez un mil PBT par une solution bloquante composée d’un mil 5% de sérum de chèvre normal dilué dans du PBT. Incuber les jambes disséquées pendant quatre heures à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Retirer la solution bloquante et la remplacer par un anticorps primaire qui est dilué dans une solution bloquante.
Ici, nous utilisons des disques anti larges à une dilution de un à 200. Remettez les assiettes sur un agitateur et incubez à quatre degrés pendant la nuit. Après l’incubation des anticorps primaires, lavez les anticorps primaires dans un million de PBT pendant trois fois brièvement, puis trois fois pendant 15 minutes chacun.
Bloquez à nouveau les tissus dans un moulin 5% de sérum de chèvre normal pendant au moins deux heures à température ambiante, ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Retirer la solution bloquante et ajouter 300 microlitres des anticorps secondaires conjugués fluorescents dilués appropriés. De plus, ajoutez une dilution à 2000 de la phalloïdine conjuguée par fluorescence pour marquer le muscle.
Pour incuber, scellez les puits avec du ruban d’étanchéité de laboratoire et un couvercle. En outre, enveloppez les plaques dans du papier d’aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière. Incuber pendant six à huit heures à température ambiante, ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Pour éliminer les anticorps secondaires non liés, effectuez des lavages avec PBT de la même manière que celle décrite précédemment lors du lavage des anticorps primaires. Après cette étape, les échantillons sont maintenant prêts à être montés et imagés. Disposez les jambes du côté antérieur vers le haut et couvrez-les avec des supports de montage supplémentaires si nécessaire.
Grattez doucement les coins d’une couverture glissez sur une boule d’argile. L’argile résultante servira d’espacement entre la lame et le glissement de couverture, de sorte que les tissus ne soient pas écrasés. Appuyez sur le glissement du couvercle jusqu’à ce qu’il touche le haut des jambes.
Scellez les bords avec du vernis à ongles et conservez-les à quatre degrés jusqu’à l’imagerie. Image par microscopie confocale utilisant les paramètres d’imagerie décrits à la section quatre du protocole écrit. Pour aider à valider le protocole de dissection, nous commençons les jambes d’image par microscopie à contraste de phase à faible grossissement.
Voici un exemple sur le panneau A d’une bonne dissection à gauche, et d’une mauvaise dissection à droite dans laquelle les fibres musculaires ont été perturbées. Le panneau C montre une image confocale d’une bonne dissection dans laquelle le muscle n’a pas été perturbé. En revanche, le panneau D montre une jambe endommagée pendant la dissection, dans laquelle les fibres musculaires sont manquantes, comme indiqué par la flèche.
Ici, nous avons taché une jambe imagée avec de la peroxydase anti-raifort pour détecter les processus neuronaux, montrés ici en vert, des disques anti grands, ce qui facilite le regroupement des récepteurs postsynaptiques du glutamate, montré en rouge, et de la phalloïdine pour marquer le muscle, montré en bleu. Lorsqu’il est capturé à un grossissement de 20X avec un canal de lumière transmise, il est facile de voir la zone disséquée. Notez que les anticorps pénètrent partiellement dans les zones non disséquées et peuvent être vus à travers la cuticule comme indiqué par la flèche blanche.
Chacun des motoneurones de la jambe fait des projections stéréotypées lors de l’innervation du muscle. Notre travail se concentre sur les motoneurones innervant le muscle releveur du tibia, représenté ici comme la région en boîte et indiqué par la flèche blanche. À un grossissement plus élevé de 60X avec un zoom 2X en haut à droite, nous pouvons efficacement imager des boutons, affichés en vert, et les DLG environnants en rouge.
Augmenter le zoom plus loin, ou passer à un objectif 100X, permet de quantifier la taille et la morphologie de la bouton comme indiqué en bas à droite. En utilisant cette technique de dissection combinée à l’immunocytochimie, nous avons constaté qu’il existe un gonflement du bouton H-dépendant dans un modèle mutant sod1 de la SLA, montré ici dans les jambes H71Y âgées, par rapport aux témoins de type sauvage comme indiqué par les flèches. Les tailles des boutons sont quantifiées dans la parcelle d’essaim d’abeilles à droite.
Nous avons également constaté une réduction du marqueur de zone active Bruchpilot, représenté en rouge, dans les axones HRP faiblement colorés, représentés en vert, des mutants H71Y. Pour étudier la neurodégénérescence, les agrégats de protéines ubiquitinées sont souvent détectés par l’anticorps FK2, et montrés ici comme puncta FK2-positifs, dans les axones et les muscles des mouches H71 de gazon âgées sur le côté droit, indiqué par les flèches. Enfin, les mitochondries peuvent être visualisées par immunocytochimie à l’aide d’un anticorps monoclonal anti ATP5a, comme indiqué ici en rouge dans le muscle releveur du tibia.
Nous avons constaté que les mitochondries s’élargissent avec l’âge chez les mutants H71Y. Une fois maîtrisée, la préparation disséquée de la jambe et la coloration des anticorps associée vous permettront d’analyser les changements moléculaires à la jonction neuromusculaire adulte pour votre mutant préféré à différents moments.
