Même les embryons très précoces contiennent de nombreuses molécules de signalisation différentes, ce qui peut rendre difficile de discerner la fonction complète de tout signal embryonnaire individuel. En isolant les cellules des centres de signalisation endogènes, ces explantes permettent aux chercheurs d’examiner le rôle d’une molécule de signalisation donnée dans un isolement relatif. Le principal avantage de cette technique est que nous sommes en mesure de récapituler le moment embryonnaire, les mouvements cellulaires et les modèles d’expression génique dans un système ex-vivo simplifié sans le temps ou les efforts nécessaires pour maintenir les cellules souches en culture.
Commencez par couper d’abord les explants des embryons non infectés. Si les explantations prolongent la culture, la coupe a été faite pour se rapprocher du jaune. Commencez par remplir une aiguille capillaire en verre tirée avec de l’ARN.
Placez l’aiguille remplie dans un micro-manipulateur et cassez le bout de l’aiguille avec la pince. Calibrer le volume d’injection à l’aide d’un micromètre d’étage avec une goutte d’huile minérale, en ajustant le temps d’injection et la pression sur l’injecteur pneumatique pour obtenir un bolus de la taille souhaitée. Gardez l’extrémité de l’aiguille à ARN immergée dans l’huile jusqu’à ce qu’elle soit prête à être injectée.
Chargez les embryons dans la plaque d’injection à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une pompe à pipette, puis utilisez un doigt ganté pour presser doucement les œufs dans les auges. Injecter 10 picogrammes ndr2 ARN dans le jaune d’embryons unicellulaires jusqu’à ce que le nombre souhaité d’embryons soit atteint ou jusqu’à ce que les embryons commencent à se diviser. Utilisez un doux jet d’eau d’œuf provenant d’une bouteille à presser pour laver les embryons de la plaque d’injection dans une boîte de Pétri étiquetée.
Placez les embryons dans l’incubateur à 28,5 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de 128 cellules. Retirez les œufs non fécondés et les embryons morts du plat. Une fois que les embryons ont atteint le stade des 128 cellules, placez-les dans des boîtes de Petri en verre étiquetées et décantez autant d’eau d’œuf que possible.
Étiquetez les plats cristallisants en verre avec du ruban adhésif de laboratoire correspondant à de petits noms de plats et remplissez les deux tiers du chemin avec de l’eau d’œuf. Placez ces plats à côté du microscope à dissection pour une accessibilité rapide. Ajouter un millilitre de 20 milligrammes par millilitre de pronase, décongelé sur de la glace à 15 millilitres de solution de 3X Danieau dans un tube conique de 50 millilitres.
Ajouter au moins cinq millilitres de solution de pronase à chaque boîte de Petri en verre contenant des embryons. Agitez les plats en verre dans un mouvement circulaire, en surveillant la progression de la décchorionation de manière cohérente sous un microscope à dissection. Une fois que les chorions commencent à se froisser et qu’un à deux embryons sont sortis de leurs chorions, trempez soigneusement la boîte de Petri en verre contenant de la pronase et les embryons dans le plat cristallisant en verre correspondant contenant de l’eau d’œuf.
Lavez les embryons de déséchorionation trois fois avec de l’eau d’œuf et décantez l’eau d’œuf du plat. Effectuez le troisième et dernier lavage avec la solution de Danieau 0,3X. Couvrir les embryons décononés avec un couvercle de boîte de Pétri et les renvoyer à l’incubateur à 28,5 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de 256 cellules.
Remplissez une boîte de Petri enrobée d’agarose avec la solution 3X Danieau. Une fois que les embryons sont au stade de 256 cellules, transférez-les dans la plaque enduite d’agarose contenant 3X la solution de Danieau, en les alignant le long du centre du plat. Utilisez une paire de pinces, maintenues fermées pour stabiliser l’embryon, et utilisez l’autre pour couper à travers le blastoderme.
Pour couper, pressez doucement les cellules du blastoderme avec une paire de pinces, puis prenez les pinces stabilisatrices et faites-les passer le long des autres pinces pour trancher environ à mi-chemin à travers le blastoderme. Faites pivoter l’embryon, en plaçant la pince dans la coupe existante, puis coupez l’orthogonal blastodermique restant à la première coupe. Conservez les explants dans la solution de 3X Danieau pendant au moins cinq minutes pour guérir, puis transférez-les dans le puits enduit d’agarose d’une plaque de six puits remplie de quatre millilitres de milieux explants.
Placez les plaques de culture d’explants dans l’incubateur à 28,5 degrés Celsius jusqu’à ce que le moment ou le stade souhaité soit atteint. Pour couper les explantes chimériques, utilisez un plat avec de l’agarose moulée dans 12 petits puits peu profonds à l’aide de perles de verre d’un millimètre. Remplissez la plaque avec la solution 3X Danieau.
Préparez-vous en ajoutant 12 embryons d’un génotype ou d’une condition sur le côté gauche de la plaque, et 12 embryons de l’autre génotype sont conditionnés sur le côté droit de la plaque. Déplacez un embryon de chaque condition au centre de la plaque près de l’un des 12 puits. À l’aide d’une pince, coupez une explantation de chaque embryon comme décrit pour les explantes d’embryons uniques.
Appuyez rapidement sur les bords coupés des deux explants ensemble dans le puits peu profond à l’aide d’une pince pour permettre aux deux moitiés de guérir ensemble en une seule explantation. Continuez avec les 12 puits restants à l’intérieur de la plaque. Une fois les explants guéris, transférez-les dans le puits enduit d’agarose d’une plaque de six puits remplie de quatre millilitres de milieux d’explants.
Répétez l’opération jusqu’à ce que le nombre souhaité d’explants soit atteint. La culture explante dans l’incubateur à 28,5 degrés Celsius jusqu’à ce que les embryons frères intacts atteignent le stade souhaité. Les explantes témoins coupées dans les embryons de type sauvage non infectés ou celles injectées avec 50 picogrammes d’ARNm codant pour une protéine fluorescente verte sont restées arrondies tout au long de la période de culture et n’ont pas réussi à exprimer les marqueurs du mésoderme, de l’endoderme ou du neuroectoderme.
Les explantes coupées à partir d’embryons injectés avec 10 picogrammes d’ARNm ndr2 sont devenues très allongées après huit à neuf heures de culture. L’imagerie time-lapse en direct de ces explants par microscopie à contraste interférent différentiel a révélé que l’extension commence à ou environ huit heures après la fécondation. Les explantations d’embryons injectés avec 10 picogrammes de ndr2 ont montré une expression robuste des marqueurs mésodermiques, tbxta, noto, tbx16 et du marqueur neuroectodermique sox2.
Il est très important de couper les explantes bien au-dessus de la marge embryonnaire. Sinon, les explants contiendront des signaux endogènes de la marge et ne seront pas naïfs. Dans cette méthode, les explants ont été utilisés pour aborder le rôle de la signalisation nodale dans la morphogenèse de gastrulation.
À l’avenir, d’autres chercheurs pourrait utiliser cette approche pour tester le rôle de molécules de signalisation supplémentaires, par exemple, dans un certain nombre de processus de développement.
