L’OCT est un agent de cryoconservation incompatible avec l’analyse par spectrométrie de masse. Grâce à ce protocole, les chercheurs peuvent retirer la TCO des tissus et quantifier les sphingolipides par chromatographie liquide en tandem. La préparation des mèches de séchage des tissus, le lavage des tissus et la pesée des tissus seront démontrés par April Boyd de la Virginia Commonwealth University, et l’extraction des lipides sera démontrée par le Dr Jeremy Allegood, directeur du Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.
Pour commencer, nettoyez les ciseaux chirurgicaux en les immergeant dans du méthanol pendant cinq minutes, puis en les essuyant avec un mouchoir propre de qualité laboratoire. À l’aide de gants sans poudre, faites tourner l’extrémité d’un mouchoir de qualité laboratoire pour créer une mèche finement effilée de 30 à 40 millimètres de long. Ensuite, à l’aide des ciseaux nettoyés au méthanol, coupez la mèche à l’extrémité épaisse et placez-la dans une boîte en carton propre.
Ensuite, à l’aide des ciseaux nettoyés au méthanol, coupez quatre à cinq millimètres de la pointe d’une pipette d’un millilitre et replacez la pointe dans le porte-pointe. Pour éliminer l’OCT des tissus, ajoutez 10 millilitres d’eau désionisée ultrapure et glacée à chaque tube contenant du tissu pulmonaire humain et coiffez-les hermétiquement. Laisser les tubes incuber pendant 10 minutes.
Tourbillonner vigoureusement chaque tube jusqu’à ce que tout le tissu déposé sur les parois du tube ou de la pastille de tissu soit complètement remis en suspension. Ensuite, centrifugez les tubes dans une centrifugeuse à godet oscillant pré-réfrigérée à 4 000 à 5 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Une fois la centrifugation terminée, décapsulez les tubes sur de la glace.
Aspirez soigneusement la solution de lavage, en laissant environ 0,5 millilitre du surnageant dans le tube, puis reboucher le tube. Après avoir retiré le surnageant de tous les tubes, lavez les mouchoirs deux fois de plus de la même manière. Après les trois lavages d’élimination OCT, utilisez l’embout de pipette raccourci préparé pour ajouter 500 microlitres de PBS glacé au tube.
À l’aide de la même pointe, remettez doucement la pastille en suspension et transférez tout le tissu remis en suspension dans un tube centrifuge pré-marqué et prépesé de 1,5 millilitre. Gardez le tube sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons de tissus soient transférés. Ensemencez les tissus en centrifugeant les tubes dans une centrifugeuse pré-refroidie, puis aspirez soigneusement autant de PBS que possible sans déranger la pastille et replacez les tubes sur de la glace.
À l’aide des mèches de séchage des tissus préparées plus tôt, retirez délicatement toute solution de lavage restante, puis fermez le tube et placez-le sur de la glace. Pour peser les tubes, placez un tube à la fois dans une balance analytique tarée et mise à zéro récemment calibrée et fermez la porte de la chambre. Une fois le poids stabilisé, enregistrez-le dans une feuille de calcul électronique.
Après pesée, replacez le tube sur de la glace et ajoutez 300 microlitres de PBS glacé. À l’aide d’une pointe de pipette raccourcie, transférer soigneusement tous les tissus dans deux millilitres de méthanol glacé dans un tube de verre à vis pré-étiqueté. Avant l’extraction des lipides, laisser les tissus et les étalons lipidiques internes de spectrométrie de masse s’équilibrer à température ambiante pendant 20 minutes, puis vorter et immerger les solutions étalons internes dans un bain-marie à ultrasons jusqu’à ce que les étalons lipidiques soient complètement dissous.
À l’aide d’une pipette répétitive, ajoutez 250 picomoles des étalons internes de spectrométrie de masse à chaque tube et rebouchez légèrement les tubes. Pour faciliter l’homogénéisation, réglez le volume de méthanol à deux millilitres, puis triturez le tissu à l’aide d’un homogénéisateur en déplaçant l’embout de l’homogénéisateur dans un mouvement circulaire appuyé doucement contre la paroi du tube. Lorsque les touffes ne sont plus visibles, reboucher le tube.
Immergez le tube à un angle de 45 degrés dans un bain-marie à ultrasons pendant 5 à 10 secondes. Ensuite, sous une hotte, ajoutez du chloroforme et du méthanol à chaque tube pour obtenir un rapport méthanol/chloroforme/eau de deux à un à 0,1. Scellez hermétiquement les tubes et laissez-les sur la paillasse jusqu’à la fin de la journée.
Avant de partir ce soir-là, placez les tubes hermétiquement bouchés dans un bain-marie de 48 degrés Celsius pour une incubation pendant la nuit. Le lendemain, pelleter tout solvant et débris solubles par centrifugation. Ensuite, dans une hotte, décanter soigneusement le surnageant dans des tubes à essai en verre borosilicaté pré-étiquetés de 13 à 100 millimètres inclinés à un angle de 30 à 45 degrés pour faciliter la décantation.
Après avoir décanté le surnageant de tous les tubes, utilisez un concentrateur sous vide à vide maximal avec une étape de chauffage initiale d’une heure à 40 degrés Celsius pour évaporer tout le solvant, puis ajoutez 500 microlitres de méthanol à chaque tube. Pour remettre en suspension les extraits lipidiques séchés, vortex du tube pendant 5 à 10 secondes, puis immergez le tube dans un bain-marie à ultrasons à un angle de 45 degrés avec rotation pendant deux minutes. Re-vortex le tube pendant cinq secondes et ré-immergez-le dans le bain-marie à ultrasons pendant une minute supplémentaire.
Retirez tous les débris insolubles par centrifugation, puis décanter le surnageant dans un flacon auto-injecteur pré-marqué incliné à un angle de 30 à 45 degrés pour faciliter la décantation. Fermez hermétiquement les flacons avant de les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. L’analyse par spectrométrie de masse en tandem par électronébulisation par chromatographie liquide après élimination de l’OCT confirme que diverses espèces de céramides et de monohexosyl-céramides de longueur de chaîne sont significativement élevées dans les tumeurs d’adénocarcinome pulmonaire humain par rapport aux tissus adjacents normaux non impliqués.
Les étalons de sphingolipides éluent séquentiellement dans l’ordre suivant : d17:1 sphingosine, d17:1 sphingosine-1-phosphate, C12 lactosyl-céramide, C12 monohexosyl-céramide, C12 sphingomyéline et céramide C12. Pour chacune de ces espèces de sphingolipides, en utilisant les paramètres de gradient et d’instrumentation dans le texte, il y a un décalage positif approximatif de 0,15 minute dans le temps de rétention pour chaque augmentation de carbone de deux longueurs de chaîne. Cependant, les lipides de longueur de chaîne plus longue tels que C24 et C26 peuvent avoir des décalages de temps de rétention plus importants.
De plus, une double liaison dans l’acide gras entraîne souvent un décalage négatif de 0,15 minute du temps de rétention. Ainsi, le céramide C18:1 aura un temps de rétention similaire au céramide C16. Plutôt que de compter presque exclusivement sur des tissus fraîchement collectés, ce protocole élargit les sources tissulaires pouvant être utilisées pour l’analyse par spectrométrie de masse pour inclure celles stockées cryogéniquement dans des dépôts biologiques.
