Dans une infection chronique par le VHB, les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans la clairance virale et les retourneurs. Cette méthode nous permet d’évaluer simultanément les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et d’identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB. La démonstration de la procédure sera faite par Jianmei Xiao, un assistant de recherche.
Et Xing Wan, un technicien de Bilao. Pour commencer, isolez les cellules mononucléaires du sang périphérique, ou PBMA, du sang, en utilisant la centrifugation par gradient de densité De Ficoll à 800 fois G pendant 20 minutes. Ensuite, collectez les granulocytes entre la couche de globules rouges et les globules rouges, à l’aide d’une pipette pasteure.
Transférer la suspension de cellule décongelée dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres, ajouter un millilitre de la benzonase RPMI 1640 préchauffée, goutter sage, puis ajouter lentement six autres millilitres. Rincez le flacon cryogénique avec deux millilitres de benzonase RPMI 1640 pour récupérer les cellules restantes. Ensuite, centrifugez le tube à 400 fois G pendant 10 minutes.
Retirez le surnageant et desserrez la pastille en tapotant le tube. Remettez délicatement la pastille dans un millilitre de Bensenase NACE RPMI 1640 chaude. Mélangez doucement les cellules et filtrez-les à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres, si des amas de cellules sont visibles.
Compter les cellules viables à l’aide du bleu de trypan et d’un hémocytomètre. Ressez suspendre les PBCC et le milieu de culture complet, contenant 10 unités par millilitre d’IL2 et 10 nanogrammes par millilitre d’IL7. Ajustez la densité cellulaire à 1,5x10 aux 6 cellules par millilitre.
Ensuite, plaquez les cellules dans des plaques à fond plat de 96 puits à une densité de 3x10 aux cinquièmes cellules par puits. Ajoutez des pools de peptides dérivés du virus de l’hépatite B ou du VHB à chaque puits. Pour les puits de fond et de contrôle positif, ajoutez la même quantité de solvant.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le troisième jour, complétez le milieu de culture avec 50 unités par millilitre d’IL2 et 10 nanogrammes par millilitre d’IL7. Le septième jour, remplacez la moitié du milieu de culture par un milieu frais contenant : quatre microgrammes par millilitre de peptides, 100 unités par millilitre d’IL2 et 20 nanogrammes par millilitre d’IL7.
Le jour 10, pipettez doucement les cellules dans chaque puits sept à neuf fois pour désagréger les grappes de cellules. Comptez le nombre de cellules viables et transférez 2x10 aux cinquièmes cellules dans chaque puits d’une plaque inférieure ronde de 96 puits pour l’analyse de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VPH. Pour les cellules résiduelles de la plaque de fond plat de 96 puits, ajustez le volume du milieu de culture à 100 microlitres en éliminant le milieu excessif.
Ensuite, complétez la culture avec 100 microlitres de milieu de culture frais et complet, contenant: quatre microgrammes par millilitre de peptides, 100 unités par millilitre IL2, et 20 nanogrammes par millilitre IL7. Continuer à cultiver les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour l’identification de l’épitope le jour 12. Lavez les cellules dans la plaque inférieure ronde de 96 puits en ajoutant 200 microlitres de RPMI 1640, en centrifugant la plaque à 550 fois G pendant trois minutes et en jetant le surnageant.
Répétez le lavage deux fois en utilisant un milieu de culture complet pour le dernier lavage. Pour chaque puits de cellules stimulées avec un pool peptidique spécifique, ajouter 200 microlitres de milieu de culture complet complétés par le même pool peptidique. Pour le puits de contrôle en arrière-plan, ajoutez un milieu de culture complet, complété par un microlitre par millilitre de DMSO.
Pour le puits de contrôle positif, ajoutez un milieu de culture complet complété par un microlitre par millilitre de DMSO, 150 nanogrammes par millilitre de PMA et un micromole par litre d’ionomycine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Après une heure d’incubation, ajouter 1,37 microgramme par millilitre de monensine à la culture.
Une fois l’incubation de six heures terminée, centrifuger la plaque à 550 fois G pendant trois minutes. Retirez le surnageant et lavez les cellules une fois avec 200 microlitres de DPP, comme démontré précédemment. Tache pour les marqueurs de surface CD3, CD4 et CD8, et un marqueur de viabilité.
Après avoir suspendu les cellules avec un vibreur, réfrigérez la plaque à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir lavé la plaque une fois avec 200 microlitres de DPBS, fixez et perméabilisez les cellules, colorez les cytokines intracellulaires, TNF Alpha et Interféron-gamma, et réfrigérez la plaque à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Lavez à nouveau les cellules et ressuscez-les dans 150 microlitres de tampon de cytométrie en flux.
Ensuite, acquérez les données de cytométrie en flux à l’aide d’un cytomètre en flux. Maintenir les lignées cellulaires B-lymphoblastoïdes allergènes, ou MLCA, dans une fiole T-75. Au jour 12 de l’expansion du PBMC, comptez le nombre de MLLC viables et transférez-les dans des tubes centrifuges de 15 millilitres.
Centrifugez les cellules à 350 fois G pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Re-suspendez la pastille cellulaire et le milieu de culture complet. Ensuite, aliquotez les MLLC dans une plaque inférieure ronde de 96 puits à 4x10 jusqu’aux quatrièmes cellules par puits, et 80 microlitres de milieu de culture complet.
Ajoutez 10 microgrammes par millilitre d’un seul peptide et définissez deux contrôles d’arrière-plan. Pulsation peptidique avec blocage HLADR et pulsation DMSO. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, pendant deux heures.
Ajouter 100 microgrammes par millilitre de mitomycine C et incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Lavez la plaque trois fois avec 200 microlitres de RPMI 1640 pour éliminer le peptide non expulsé et la mitomycine C, puis ressusquez les cellules dans 120 microlitres de milieu de culture complet, à l’aide d’un vibromasseur. Le jour 12 de l’expansion pbMC, transférez les PBMC sur une plaque inférieure ronde de 96 puits.
Centrifugez les cellules dans la plaque, retirez le surnageant et lavez-les deux fois avec 200 microlitres de RPMI 1640, comme démontré précédemment. Re-suspendez les PBCC dans chaque puits avec 210 microlitres de milieu de culture complet. Pour les puits PBMC choisis pour l’identification des épitopes, aliquotez 70 microlitres de la suspension cellulaire et mélangez-les avec des MLLC pulsés peptidiques dans trois puits, y compris deux contrôles de fond.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures. Après une heure d’incubation, ajouter 1,37 microgramme par millilitre de monensine à la culture et porter le volume final dans chaque puits à 200 microlitres avec un milieu de culture complet. Dans cet exemple représentatif, les réponses des lymphocytes T CD4 sécrérant du TNF Alpha et de l’interféron-gamma pour le pool de peptides Core11 sont inférieures à deux fois les valeurs de fond, donc considérées comme négatives.
Pendant ce temps, les réponses pour le pool de peptides Core09 sont supérieures à deux fois le fond et considérées comme positives. Le fond gris indique que Wells avec une réponse positive des lymphocytes T CD4 et les peptides candidats pour l’identification de l’épitope sont indiqués en rouge, Core01 a le taux de réponse le plus élevé, à en juger par les cellules CD4T sécrécrant du TNF Alpha et de l’interféron-gamma dans les pools de peptides de colonne. Les peptides C1 à 15, C31 à 45, C61 à 75 et C91 à 105 dans ce pool de peptides, sont définis comme peptides candidats car la rangée de pools de peptides contenant ces peptides montre également des résultats positifs.
Les PBCC élargis avec des pools de peptides Core07, 08, 09 et 10, sont utilisés pour l’identification des épitopes de ces peptides. De même, Core09 a le taux de réponse le plus élevé dans les pools de peptides de ligne. Tous les peptides de ce pool sont définis comme peptides candidats et les PBMCs élargis avec des pools de peptides: Core01, 02, 03, 04, 05 et 06 sont utilisés pour l’identification des épitopes de ces peptides.
Pour les PBMC élargis Core08 du pool de peptides, après stimulation avec le peptide C31 à 45 BLCL pulsés, les fréquences des lymphocytes T CD4 sécrécrant du TNF Alpha et de l’interféron-gamma sont deux fois plus élevées que les témoins de fond. Ainsi, le peptide C31 à 45 est un épitope vérifié des lymphocytes T CD4 restreints par HLADR. C’était là, d’autres PBMC élargis restant après l’identification de l’épitope.
Le marquage fin des épitopes identifiés peut être effectué à l’aide d’un panel de peptides raccourcis.
