Ce protocole comprend une nouvelle stratégie chimique visant à annexer les peptides thérapeutiques aux surfaces métalliques et a le potentiel d’améliorer la biocompatibilité d’un large éventail de biomatériaux métalliques. Il s’agit d’une technique universelle et robuste pour annexer les peptides et les protéines thérapeutiques aux surfaces métalliques nues des bioimplants. Nous avons utilisé cette technologie pour améliorer la biocompatibilité des endoprothents métalliques en appending peptides CD47 afin de prévenir les réponses inflammation qui sont déclenchées par stenting.
Commencez par laver les coupons en papier d’aluminium inoxydable ou les disques en maille avec 2-isopropanol dans un shaker pendant cinq minutes. Effectuez ce lavage deux fois, puis lavez les échantillons deux fois avec du chloroforme pendant 10 minutes par lavage. Placer les échantillons d’acier inoxydable nettoyés dans un four à 220 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Immerger les feuilles cuites au four ou les disques en maille dans la solution 0,5% aqueuse de PABT et les incuber dans un shaker pendant une heure. Lavez les échantillons modifiés par pabt avec de l’eau distillée déionisée cinq fois. Transférer les spécimens dans un nouveau flacon et répéter les lavages.
Traiter les échantillons avec tcep pendant 15 minutes à température ambiante sur un shaker. Degas a déionisé l’eau distillée dans un flacon de fond rond avec un dispositif générateur de vide, comme un lyophilisateur, et laver les feuilles ou les disques de maille avec l’eau dégazée cinq fois. Transférer les échantillons sur un nouveau flacon et répéter les lavages.
Préparez cinq millilitres de solution PEI-PDT à 1 % en diluant 212,5 microlitres du stock PEI-PDT et 125 microlitres d’acétate de sodium molaire de 0,4 molaire dans l’eau dégazée. Incuber les spécimens en acier inoxydable lavés avec 1 % de PEI-PDT. Remplacer l’air par du gaz argon, sceller les flacons hermétiques et les mélanger sur un shaker pendant une heure.
Procéder immédiatement à la conjugaison peptidique ou conserver les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Préparez une milligramme par millilitre de solution de stock de peptide humain CD47 en dissolvant la poudre humaine de PEPTide CD47 dans de l’acide acétique dégazé à 50 %, puis préparez la solution de travail en dissolvant 500 microlitres du stock en 4,5 millilitres de PBS dégazé. Incuber les échantillons recouverts de PEI-PDT lavés avec la solution de travail du peptide CD47 à température ambiante avec des secousses pendant une heure.
Une fois terminé, lavez les échantillons recouverts de peptide CD47 tels que décrits dans le manuscrit du texte. Après avoir enduit les feuilles métalliques de peptide CD47 ou de peptide brouillé, couper les tubes en PVC d’un quart de pouce en trois morceaux de 38 centimètres de long et insérer jusqu’à huit peptides brouillés non modifiés ou des feuilles de métal modifiées par le peptide CD47 dans trois tubes différents. Recueillir 30 millilitres de sang auprès de donneurs humains en bonne santé exempts de tout médicament anti-plaquettaires, précharger la seringue avec un millilitre de citrate de sodium de 4% pour prévenir la coagulation du sang recueilli.
Mettez 10 millilitres de sang dans chaque tube à l’aide d’une seringue de 10 millilitres et connectez les extrémités avec des adaptateurs métalliques. Placez les tubes remplis de sang sur les roues de l’appareil de boucle Chandler et passez le sang le long des feuilles métalliques par rotation des roues à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Égoutter le sang des tubes et l’éliminer selon les exigences de la CISR, puis couper les tubes avec un scalpel pour récupérer les feuilles.
Préparez une solution de glutaraldehyde de 2 % en diluant la solution de 70 % dans le tampon cacodylate de sodium avec du chlorure de sodium molaire de 0,1 molaire. Incuber les feuilles dans la solution de glutaraldehyde à 2 % pendant 15 minutes et les conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Avant d’analyser les feuilles métalliques, lavez-les trois fois avec du PBS.
Chauffer huit millilitres de PBS dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Préparez une solution de stock de colorant CFDA de 10 millimolaires en ajoutant 90 microlitres de DMSO à un flacon CFDA, puis préparez la solution de travail en ajoutant 75 microlitres du stock CFDA au PBS chaud. Inverser le tube à quelques reprises pour le mélanger et le couvrir de papier d’aluminium.
Placer chaque feuille dans un millilitre de colorant CFDA dans une assiette de 24 puits. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis laver les feuilles trois fois dans PBS et les imager avec un microscope à fluorescence. La concentration de peptide conjugué TAMRA CD47 covalently lié a été quantifiée pour déterminer la densité maximale d’immobilisation du peptide sur la surface métallique.
La rétention maximale de peptide était d’environ 180 nanogrammes par centimètre carré, ce qui a été réalisé avec une concentration d’entrée de 100 microgrammes par millilitre. L’immobilisation du peptide conjugué TAMRA CD47 sur les surfaces métalliques modifiées a été corroborée par une microscopie de fluorescence, qui a montré une fluorescence uniforme émise par la surface des disques de maille conjugués au peptide CD47 de TAMRA. Seule une fluorescence minimale a été détectée à la surface des mailles de contrôle qui n’avaient pas la modification, excluant ainsi un peptide cd47 conjugué TAMRA non spécifiquement lié comme principale source de fluorescence.
Il a également été confirmé que les surfaces enduites de peptide CD47 montrent une réduction drastique de l’attachement cellulaire transmis par le sang par rapport aux commandes de peptide modifiées et non modifiées brouillées. Les monocytes isolés des cellules de manteau buffy de rat ont été cultivés sur le métal nu et les feuilles d’acier inoxydable CD47-modifiées de peptide. Une atténuation de 58% de l’attachement aigu de monocyte, de leur conversion aux macrophages, et de la prolifération de macrophage a été observée sur les surfaces fonctionnalisées.
Tout en essayant ce protocole, il est très important d’effectuer les étapes impliquant de l’eau dégazée ou des reagents à effectuer aussi rapidement que possible et de minimiser l’exposition à l’oxygène. Notre technologie module sélectivement l’interaction cellulaire avec les surfaces métalliques et un essai typique d’identification de type cellulaire, tel que RT-PCR, cytométrie d’écoulement, et immunofluorescence, sont compatibles avec cette technique. Lorsqu’elle est développée pour une gamme de peptide bioactif, cette technologie peut jouer un rôle déterminant dans l’augmentation de la biocompatibilité à l’interface des matériaux tissulaires.
