Conpokal combine microscopie confoccale avec microscopie à force atomique à l’aide d’une sonde pour percer la surface de l’échantillon. Bien que les deux techniques soient efficaces individuellement, Conpokal facilite la co-localisation de la fluorescence avec caractérisation mécanique. Le principal avantage de la technique Conpokal, est la double microscopie quasi simultanée.
Confocal étudie le cytosquelettique et d’autres processus cellulaires avant et après l’enquête de l’AFM, qui fournit des propriétés mécaniques spécifiques à la zone. Cette technique est perspicace dans le domaine de la mécanobiologie car, par exemple, les cellules cérébrales peuvent être sondées dans des conditions physiologiques pour examiner les impulsions électriques et la transaction de force. Avant de commencer l’analyse, choisissez un porte-à-faux AFM approprié pour la collecte de données souhaitée et utilisez des gants, l’étape de montage des copeaux AFM, des pinces à épiler et un petit tournevis pour monter la puce dans le bloc de verre.
Placez soigneusement la puce AFM sur le centre du bloc de verre. Le porte-à-faux plus une très petite partie de la puce AFM doit se faire dans la partie visible et non opaque du bloc de verre. Utilisez le tournevis pour serrer la vis jusqu’à ce que la puce soit bien ajustée contre le bloc de verre, et utilisez une lentille pour vérifier que la puce est bien orientée.
Lorsque la puce a été correctement orientée, placez le bloc de verre dans la tête de l’AFM dans l’orientation appropriée et verrouillez le bloc de verre en place. Après avoir localisé le fond du plat d’étalonnage par microscopie à champ lumineux, utilisez le panneau de commande moteur stepper Z du système AFM pour déplacer le porte-à-faux AFM de 2000 microns au-dessus de l’échantillon. À l’aide de l’éclairage du champ lumineux et du panneau de commande moteur z stepper, abaissez lentement la puce AFM au fond de la boîte de verre par étapes de 100 à 200 microns pour éviter de planter la pointe de l’AFM dans la boîte de Pétri.
Localisez les micromètres manuels qui contrôlent X Y ou en mouvement ordinaire de la tête AFM sur la plate-forme de l’instrument. À mesure que l’ombre du porte-à-faux AFM s’assombrit et que la forme devient plus nette, utilisez les micromètres manuels pour corriger la tête de l’AFM et ajuster la position du porte-à-faux AFM dans le champ de vision. À ce stade, les tables de rechercher peuvent avoir besoin d’être ajustées.
Surveillez l’apparaître d’une ombre dans la vue logicielle du microscope, ce qui indique que la pointe AFM se rapproche du fond du plat. Continuer à utiliser de petites étapes pour abaisser la pointe AFM jusqu’à ce que la pointe est principalement au point. Lorsque le laser est en position, utilisez les cadrans d’alignement laser pour positionner le laser sur le dos de l’endroit où la pointe AFM est située sur le porte-à-faux.
Le panneau d’alignement laser doit afficher un signal de somme supérieur à zéro volts. Déplacez le laser, une petite distance dans toutes les directions sur le porte-à-faux AFM, jusqu’à ce que le signal de somme maximale soit atteint tout en restant à la pointe AFM. Une fois la position laser réglée, utilisez les cadrans de déflexion contrôlés manuellement pour zéro la déviation verticale et latérale.
Utilisez les boutons de déflexion verticale et latérale pour aligner le détecteur de sorte que la cible soit centrée et qu’il n’y ait pas de déflexion verticale ou latérale observée dans le panneau d’alignement laser. Ouvrez la fenêtre d’étalonnage et entrez toutes les informations spécifiques aux expériences. Remplacez le filtre laser.
Avant de calibrer, éteignez la source de lumière du microscope confocal et fermez l’enceinte de l’AFM pour atténuer tout bruit potentiel provenant de la lumière ou des vibrations de la pièce. Appuyez sur le bouton Étalonnage pour permettre automatiquement au système de calibrer la pointe. Lorsque l’étalonnage est terminé, la rigidité du porte-à-faux et sa sensibilité seront affichées dans le panneau d’étalonnage.
Utilisez ensuite le bouton de commande d’approche automatisée pour abaisser la pointe au bas du plat de l’échantillon et définir la taille de la zone de la peau, la résolution, le point défini, la longueur Z et le temps de pixel, avant d’appuyer sur le bouton de lecture pour commencer la numérisation. Pour l’imagerie au microscope confocal dans le logiciel microscope, activer les capacités confocal et sélectionner les lignes laser appropriées pour les colorants qui ont été utilisés pour tacher les échantillons. Sélectionnez une ou plusieurs lignes laser pour exciter et imager ces fonctionnalités dans l’échantillon et définir le gain à une valeur qui optimise la fluorescence de l’échantillon, mais limite la quantité de bruit.
Réglez la puissance laser pour éviter les pixels saturés tout en maximisant la plage dynamique et réglez la taille du sténopé à une unité de zone pour maximiser la résolution pour la section optique. Si nécessaire, ajustez les valeurs en fonction de la luminosité de l’échantillon. Pour régler le temps de vie du pixel, commencez par environ deux microsecondes de temps de vie, et ajustez-vous pour refléter la luminosité de l’échantillon au besoin.
Pour sélectionner la taille du pixel pour l’objectif sélectionné, laissez l’instrument calculer la taille du pixel via le bouton d’option Nyquist et le nombre sélectionné de pixels dans l’image. Ensuite, sélectionnez l’option Scan et commencez la collecte de données. Utilisez le bouton de mise au point pour localiser le plan focal représentant les caractéristiques des échantillons dans sa forme la plus claire, le bouton Scan pour commencer la collecte de données, et le bouton Capture pour capturer une image bidimensionnelle.
À l’aide du panneau qui contrôle la taille du pixel via l’option Nyquist, réduisez la taille de la zone de l’analyse pour n’envelopper qu’une seule cellule. Activez l’outil de collecte et en utilisant une option de bas en haut, avec seulement la ligne laser qui illumine une fonctionnalité de l’échantillon le plus clairement, définissez les plans de départ et de finition pour que le volume soit mesuré à l’aide de l’espacement suggéré entre les plans. Nommez le fichier et enregistrez-le dans le dossier associé.
Alternativement, si notre connaissance priori de l’épaisseur des échantillons existe, sélectionnez le plan moyen le plus brillant, le plus pointu, en ajustant la mise au point pour définir le volume et définir le dessus pour avoir l’épaisseur de l’échantillon au-dessus du plan du milieu, et le fond d’avoir l’épaisseur au-dessous du plan du milieu, puis sélectionnez la taille de l’étape appropriée. Exécutez l’acquisition en appuyant sur le bouton Run Now. Lorsque l’acquisition se termine, enregistrez le fichier dans le dossier approprié.
À la fin de l’expérience, portez des gants tout en enlevant le bloc de verre et placez-le dans la station de montage. Utilisez des pinces à épiler avec des poignées en caoutchouc pour enlever soigneusement la puce AFM et placer la pointe utilisée de nouveau dans l’emplacement de la boîte de stockage orientée hors accès pour indiquer qu’il a été utilisé. Pour référence future, notez quel pourboire a été utilisé dans l’expérience.
Ici, un balayage représentatif d’AFM au-dessus d’une cellule vivante de HEK est montré. La hauteur de cette cellule HEK particulière était d’environ 10 microns comme le démontre le balayage de la ligne. Ici, un exemple d’un mauvais balayage dû à un mauvais choix de pointe d’AFM peut être observé.
Dans cette image, des pixels noirs sont apparus au sommet de la cellule indiquant que la zone de sonorisation AFM était hors de portée en raison d’une grande hauteur cellulaire. L’extrémité du porte-à-faux AFM apparaît également dans l’image en raison de la pointe offset combinée avec une hauteur de pointe insuffisante par rapport à la hauteur de la cellule. Ces artefacts dans l’image de l’AFM indiquent qu’une autre pointe d’AFM aurait dû être choisie pour l’image de la cellule.
Trois images confoccales de couleur peuvent être exécutées. Par exemple, pour visualiser le noyau cellulaire, les micro tubules et la membrane lipophile. L’analyse des indentations de pointe en combinaison avec le modèle nanomécanique, permet la génération d’une carte modulus de la surface.
Ici, une projection 3D correspondante de la pile laser confoccal Z est affichée. Des balayages d’AFM et des cartes mesurées de modulus peuvent également être acquis pour des microbes, comme observé dans ces analyses représentatives de la bactérie de mutans de streptococcus. Comme démontré, une meilleure résolution peut être obtenue à cette échelle avec l’AFM, qu’avec la microscopie confoccale traditionnelle.
La cartographie de la force adhésive est une technique effectuée par conpokal pour visualiser les interactions moléculaires. Par exemple, étudier la modulation des molécules de surface cellulaire pour observer la cinétique contraignante. Conpokal inaugure une nouvelle voie pour explorer les relations de fonction de structure en microbiologie médicale.
Par exemple, les événements physiques et chimiques et la couche peptidoglycane, peuvent être liés à la résistance aux antibiotiques.
