Les méthodes de quantification de diverses particules représentent un aspect critique de la plupart des études de biologie. Ce protocole permet une quantification précise des données virales en temps réel. Cette technique remplace la mesure traditionnelle des données virales.
Grâce à des données objectives en temps réel, nous sommes en dessous de notre intervalle de confiance, évitant les critères d’évaluation à forte intensité de main-d’œuvre. Cette méthode peut être utilisée pour tous les virus qui induisent un effet cytopathique. Quentin Grassin, un technicien de laboratoire de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour propager et amplifier les virus H1N1, ensemencez 7,5 fois 10 aux 6 cellules MDCK sur deux flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés selon les protocoles standard, et incubez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius pour atteindre 90 à 100% de confluence. Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS stérile par flacon et par lavage et étiquetez une fiole comme témoin. Ensuite, diluer un flacon décongelé de virus de la grippe A à la concentration expérimentale appropriée dans un tube de 1,5 millilitre contenant un milieu de propagation du virus frais.
Utilisez un millilitre du stock dilué pour infecter les cellules MDCK à une multiplicité d’infection de 1 fois 10 à 3 négatifs, ou de 1 fois 10 à 4 unités formant de la plaque négative par cellule, et ajoutez un millilitre de milieu de propagation du virus à la fiole témoin. Adsorbez le virus dans les cellules pendant 45 minutes à température ambiante, en remuant toutes les 15 minutes. À la fin de l’incubation, retirer l’inoculum et le remplacer par 15 millilitres de milieu de propagation du virus complétés par un microgramme par millilitre de trypsine TPCK pour faciliter le clivage de l’hémagglutinine virale HA0 en sous-unités HA1 et HA2.
Ensuite, placez la fiole dans l’incubateur à 35 degrés Celsius pendant trois jours. À la fin de l’incubation, comparez les cellules de chaque culture sous un objectif 40x sur un microscope optique pour évaluer les effets cytopathiques sur les cellules. Lorsque l’effet cytopathique est terminé, ajoutez les surnageants de culture cellulaire dans un tube de 15 millimètres et collectez les débris cellulaires de chaque culture par centrifugation.
Ensuite, transférez le surnageant de culture du virus clarifié dans un tube de 15 millilitres et aliquotez les virus de la progéniture dans des flacons cryogéniques stériles à usage unique pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer la quantité cellulaire appropriée pour l’infection cellulaire, préparez des cultures cellulaires MDCK confluentes d’environ 80 % sur 24 heures, comme démontré, avant de laver les cellules avec du PBS et de les récolter avec une incubation de 45 minutes dans trois millilitres de 0,25 % de trypsine-EDTA par flacon à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec sept millilitres de milieu de culture frais par fiole et comptez les cellules de chaque culture.
Diluer les cellules à 4 fois 10 à 5ème cellules par millilitre de milieu de culture cellulaire et effectuer deux fois les dilutions en série des cellules comme indiqué. Placez une plaque E à température ambiante pendant plusieurs minutes avant d’ajouter 100 microlitres de milieu de culture cellulaire à chaque puits sans toucher les électrodes de la plaque E. Déverrouillez les berceaux et insérez l’extrémité avant de la plaque dans la poche du berceau de l’instrument de mesure de l’impédance.
Fermez la porte de l’incubateur et ouvrez le logiciel. Dans la configuration du modèle d’expérience par défaut, mettez en surbrillance les stations d’accueil sélectionnées et double-cliquez sur la page supérieure pour entrer le nom de l’expérience. Cliquez sur Disposition et entrez les informations d’échantillon nécessaires pour chaque puits sélectionné de la plaque.
Cliquez sur Planifier, Étapes et Ajouter une étape. Le logiciel ajoutera automatiquement une étape d’une seconde pour mesurer l’impédance d’arrière-plan Cliquez sur Exécuter et Démarrer, Continuer. Cliquez sur Tracer et ajouter pour sélectionner les puits appropriés, en confirmant que l’impédance d’arrière-plan est comprise entre 0,1 et 0,1 négatif avant de passer à l’étape suivante.
Ensuite, retirez la plaque du berceau et ajoutez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire aux puits appropriés en double exemplaire. Laissez la plaque E dans la hotte à écoulement laminaire pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre une distribution uniforme des cellules sur le fond des puits avant de charger la plaque E dans la poche du berceau. Cliquez sur Planifier et ajouter une étape et entrez des valeurs pour surveiller les cellules toutes les 30 minutes pendant 200 répétitions avant de sélectionner Démarrer, Continuer.
Pour vérifier et tracer les données d’impédance cellulaire, cliquez sur Tracer et sélectionnez la concentration de cellules qui se trouve juste avant la phase stationnaire 24 heures après l’ensemencement pour obtenir des cellules qui sont encore dans une phase de croissance pendant l’infection virale. Pour déterminer la corrélation entre les valeurs CIT50 et la multiplicité de l’infection, après avoir cultivé 3 fois 10 à la 4e cellule MDCK fraîchement divisée dans chaque puits de la plaque de microtitrage électronique pendant 24 heures, laver les cellules deux fois avec 100 microlitres de milieu de propagation du virus frais par puits, par lavage, et utiliser une pipette à canal unique pour ajouter 100 microlitres de suspension virale à chaque puits. Lorsque toutes les dilutions du virus ont été ajoutées, chargez doucement la plaque dans la poche du berceau de l’instrument à 35 degrés Celsius et commencez à surveiller l’impédance cellulaire toutes les 15 minutes pendant au moins 100 heures, comme démontré.
Après deux cycles de mesures, cliquez pour mettre l’appareil en pause et retirez la plaque E du berceau. Ajouter 100 microlitres de milieu de propagation du virus complété par de la trypsine TPCK à chaque puits et retourner la plaque E dans la poche du berceau. Ensuite, commencez l’analyse.
Pour évaluer la cinétique de survie du virus de la grippe A, ajouter du chlorure de sodium à une concentration finale de 35 grammes par litre dans de l’eau distillée et ajouter 900 microlitres de la solution saline résultante dans des cryotubes de deux millilitres. Ajouter 100 microlitres de matière virale à chaque cryotube et placer les tubes dans l’incubateur à 35 degrés Celsius pendant la période expérimentale appropriée. La veille de la fin de l’incubation, ensemencez 3 fois 10 à la 4ème cellule MDCK fraîchement divisée et 100 microlitres de milieu de propagation du virus par puits dans une plaque de microtitrage de 16 puits par étapes répétées, permettant de mesurer l’impédance de fond et la distribution uniforme des cellules sur le fond des puits.
Ensuite, cultivez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez les cellules deux fois, puis infectez les cellules avec 100 microlitres du virus distillé dans une solution saline diluée 10 fois dans un milieu de culture frais, comme démontré, et surveillez l’impédance cellulaire toutes les 15 minutes pendant au moins 100 heures. Ici, les données brutes obtenues après 120 heures avec différentes concentrations de cellules MDCK sont montrées.
Après 24 heures, les mesures de l’indice cellulaire ont révélé que les cellules dans les puits ensemencés avec 3 fois 10 à la 4ème cellule étaient encore dans la phase exponentielle de croissance, par conséquent, cette concentration cellulaire a été utilisée pour des expériences ultérieures. Les cultures de cellules MDCK démontrent une relation linéaire claire entre le CIT50 et la multiplicité initiale de l’infection par le virus de la grippe. Les résultats d’une expérience cinétique de survie typique montrent une diminution de l’indice cellulaire due à l’effet cytopathique induit par le virus.
Le CIT50 peut être utilisé pour calculer la pente d’inactivation virale pour chaque virus dans chaque condition afin de déterminer quel virus avait la plus grande stabilité dans l’environnement étudié. La stabilité du virus est indirectement corrélée à la pente d’inactivation, ce qui permet, par exemple, d’identifier les résidus d’acides aminés dans la glycoprotéine d’hémagglutinine qui sont impliqués dans la survie du virus de la grippe A à l’extérieur de l’hôte. Cette technique est très sensible aux petites variations.
Par conséquent, l’utilisation d’un compteur de cellules automatique est encouragée afin d’obtenir des résultats reproductibles entre les expériences. Cette méthode peut également être utilisée pour comparer la réplication de différents virus, pour étudier le tropisme du virus pour plusieurs lignées cellulaires à la fois, ou pour étudier des étapes spécifiques du cycle du virus.
