L’analyse de ligature de proximité permet aux utilisateurs de détecter les interactions protéine-protéine in situ, révélant les modèles spatiaux et temporels des interactions. Cette technique peut aider à répondre à d’importantes questions sur la réglementation du développement de C.elegans. Cette technique offre une sensibilité comparable pour la détection des interactions protéines-protéines sans la complexité d’autres techniques, telles que fret et BiFC.
Les individus qui n’ont jamais disséqué les vers pour libérer les 9eds peuvent avoir du mal avec cette étape. Pratiquez la dissection des vers et utilisez-les pour l’immunofluorescence afin de perfectionner les techniques de manipulation et de dissection avant de passer à l’APL. Pour commencer, choisissez de 30 à 40 jeunes vers adultes dans un plat en verre de montre contenant 500 microlitres de 1x M9 et levamisole.
Après avoir recueilli les vers, retirer soigneusement et jeter la plupart des médias pour éliminer les bactéries qui sont transférées avec les vers. Ajouter 500 microlitres frais de 1x M9 et levamisole, et utiliser la pipette pour dessiner doucement et distribuer le média pour rincer les vers. Retirez et jetez soigneusement la plupart des supports.
Répétez le lavage deux à trois fois. Après les lavages, laissez les vers dans environ 100 microlitres de médias pendant au plus huit minutes. À l’aide d’une pipette en verre ou en polyéthylène, transférer les vers dans une glissade au microscope de 25 millimètres par 75 millimètres recouverte de poly-L-lysine à 001 %.
Retirez l’excès de supports de sorte qu’environ 15 microlitres de médias restent sur la diapositive. L’élimination de l’excès de tampon est essentielle pour s’assurer que les vers et les 9eds disséqués adhèrent à la diapositive. Sous un microscope disséquant, avec deux aiguilles de calibre 26 1/2, placez une aiguille sur l’autre de sorte que les extrémités forment une paire de ciseaux.
En utilisant les aiguilles orientées de cette façon, couper les vers derrière le pharynx pour libérer les germlines. Disséquez tous les vers en cinq minutes. Une fois que tous les vers sont disséqués, placez doucement un couvercle de 22 millimètres par 40 millimètres sur la glissière de sorte qu’il soit perpendiculaire à la diapositive.
Les extrémités du coverslip doivent accrocher la glissière. Congeler les glissières sur un bloc d’aluminium pré-réfrigéré maintenu sur de la glace sèche pendant au moins 20 minutes. Placez délicatement un crayon réfrigéré sur le dessus du coverslip pour empêcher le coverslip de se détacher en raison de l’expansion de la glace.
Une fois prêt pour la fixation, feuilletez les coverslips avec un crayon, et trempez immédiatement la glissière dans un bocal contenant du méthanol frais et glacé pendant une minute. Essuyez ensuite délicatement les bords de la lame entourant l’échantillon et appliquez 150 microlitres de fixatif de formaldéhyde à température ambiante pour fixer pendant cinq minutes. Touchez la lame à une serviette en papier à un angle perpendiculaire de 90 degrés pour laisser le fixatif s’enfuir de la glissière et absorber dans la serviette en papier.
Bloquez les toboggans deux fois pendant 15 minutes à température ambiante dans un bocal Coplin avec 50 millilitres de PBT/BSA. Bloquez ensuite les glissières avec une solution PBT/BSA contenant 10% de sérum de chèvre normal. Essuyez doucement les bords qui entourent la glissière et appliquez 100 microlitres de la solution sur chaque glissière.
Et agitez doucement la lame pour aider à répandre la solution. Incuber pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide. Placez la lame sur une serviette en papier pour laisser la solution s’enfuir de la glissière et essuyez doucement les bords.
Pour bloquer les glissières, appliquez une goutte du réaccente de blocage sur l’espace de 14 millimètres par 14 millimètres. Incuber les toboggans pendant une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humide. Placez les glissières sur une serviette en papier pour laisser le reagent bloquant s’enfuir de la glissière et essuyez doucement les bords.
Utilisez le diluant anticorps pour diluer les anticorps primaires. Appliquez 40 microlitres de la solution d’anticorps primaire diluée par espace de 14 par 14 millimètres sur les glissières. Placez les glissières dans une chambre humide et incubez la nuit à quatre degrés Celsius.
Le matin, lavez les glissières deux fois pendant cinq minutes, chacune avec 50 millilitres de tampon de lavage 1x A à température ambiante dans un bocal Coplin. Placez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 rpm. Placez les glissières sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’enfuir de la glissière et essuyez doucement les bords.
Préparez une solution de 40 microlitres contenant des sondes plus et moins. Ajoutez la solution à chaque espace de 14 par 14 millimètres. Incuber les toboggans dans une chambre humide pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Lavez les glissières deux fois pendant cinq minutes chacune avec 50 millilitres de tampon de lavage 1x A à température ambiante dans un bocal Coplin. Placez le pot Coplin sur un shaker orbital réglé à 60 rpm. Diluer le tampon de ligature un à cinq avec de l’eau ultrapure.
Utilisez ce tampon pour diluer la ligase un à 40 pour préparer un stock de travail de solution de ligature. Placez la lame sur une serviette en papier pour laisser le tampon de lavage s’enfuir des côtés et essuyez doucement les bords. Ajouter 40 microlitres de la solution de ligature à chaque espace de 14 x 14 millimètres.
Incuber les toboggans dans une chambre humide pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après le lavage et le séchage des glissières comme décrit précédemment, ajoutez 40 microlitres de solution d’amplification fraîchement préparée, protégée de la lumière, à chaque espace de 14 par 14 millimètres. Incuber les toboggans dans la chambre humide et sombre pendant une heure et 40 minutes à 37 degrés Celsius.
Lavez les glissières deux fois pendant 10 minutes chacune avec 50 millilitres de tampon de lavage 1x B, et lavez les glissières une fois pendant une minute avec 50 millilitres de tampon de lavage 01x B.Après avoir sec le périmètre époxy-enduit de la glissière, ajoutez 10 microlitres de milieu de montage à chaque échantillon, et mentez doucement un coverslip sur le dessus, permettant au milieu de montage de s’étendre. Peindre autour du bord du coverslip avec du vernis à ongles pour sceller le coverslip et glisser. Évitez de déplacer le coverslip.
Laisser durcir le vernis à ongles pendant au moins 20 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. La co-immunostaining des germlines avec des anticorps flag et GFP a indiqué leur modèle d’expression dans la germline. Tandis que GFP a été exprimé tout au long de la germline, l’expression d’OMA-1:GFP a été limitée au pachytene et aux ovocytes tardifs.
L’immunostaining flag montre que 3xFLAG:DLC-1 a été exprimé dans toute la lignée germinale dans les deux souches. La région d’intérêt pour la quantification de PLA dans la germline a inclus le pachytene tardif par les ovocytes dans toutes les lignées germinales. C’est la région de l’expression OMA-1.
3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP germlines semblaient avoir une plus grande quantité de foyers PLA dans cette région par rapport à la 3xFLAG:DLC-1, germlines GFP. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’eau pour augmenter l’humidité dans la chambre. Assurez-vous également que les glissières sont à niveau à l’intérieur de la chambre pour éviter le ruissellement des reagents.
Après l’essai de ligature de proximité, les 9odes extrudés peuvent être imités sur un microscope confocal et quantifiés à l’aide de Fidji, flux de travail ImageJ. Cette quantification peut aider à déterminer si l’interaction est statistiquement significative. L’APL nous a permis d’évaluer les interactions in situ entre les régulateurs critiques du développement de la germline nématode.
