L’imagerie hyperspectrale permet l’acquisition d’informations spectroscopiques à des endroits précis au sein d’un échantillon. Par exemple, pour le dévoilement de l’anisotropie optique à un seul niveau de cristal. La génération de données spectrales et spatiales d’un échantillon permet une étude plus détaillée de l’échantillon que ne le permet la spectroscopie ou la microscopie par fluorescence seule.
Un grand nombre de paramètres réglables qui affectent la résolution peuvent sembler accablants au début. Toutefois, l’élaboration d’une liste de vérification peut vous aider à vous familiariser avec le système. Cette technique nécessite un réglage manuel du matériel d’imagerie ainsi qu’une manipulation logicielle.
Il est essentiel d’illustrer visuellement ces deux aspects pour montrer comment les deux méthodes se complètent. Emily Rodrigues, post-doctorante à mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec Nelson Rutajoga. Pour configurer la configuration de l’imageur pour la cartographie de l’imagerie hyperspectrale, à partir de l’étape du microscope et en suivant la voie du faisceau d’émission vers les détecteurs, laissez la position d’un cube optique juste à côté du microscope optique vacante et placez le cube optique du microscope confocal dans cette position qui dirige l’émission de l’échantillon à travers le chemin de lumière visible.
En regardant le long du chemin optique vers le détecteur, placez le cube optique visible contenant le miroir dichroïque et les filtres pour diriger l’émission visible vers le chemin de détection dans sa position. En continuant le chemin vers le détecteur, placez le cube optique confocal de sténopé dans la bonne position pour diriger la lumière par le chemin visible de détection de lumière et suivant ce chemin, placez le cube optique confoccal de spectromètre dans la position appropriée de sorte que la lumière émise atteigne le détecteur. Lorsque tous les cubes sont en place, ajustez manuellement l’ouverture de fente du détecteur pour correspondre à la taille du sténopé sélectionné.
Ensuite, dans le logiciel PHySpec, sélectionnez l’ouverture du sténopé. Pour la cartographie d’imagerie hyperspectrale du terbium europium bi-pyrimidine trifluoroacetylacetonate cristal unique, positionner manuellement l’objectif 20 fois du microscope optique sous l’échantillon et appuyez sur le bouton blanc sur le côté gauche du microscope pour allumer la lumière blanche. Tournez le bouton sous le bouton pour ajuster la luminosité.
Réglez le bouton avant sur le côté droit du microscope à R pour envoyer 20% du signal à la caméra et 80% du signal au détecteur. Appuyez sur jouer dans la fenêtre de la caméra couleur au logiciel PHySpec pour lancer un scan en direct. Si la fenêtre de la caméra couleur affiche une image trop foncée ou noire, augmentez le temps d’exposition et/ou la valeur de gain sous l’onglet appareil photo couleur.
Si l’image est trop lumineuse, diminuez le temps d’exposition et/ou gagnez de la valeur. Pour vous concentrer sur l’échantillon, tournez les boutons du microscope pour ajuster la distance entre l’objectif dans la scène et ouvrez l’obturateur de lampe à large bande pour permettre l’excitation UV de l’échantillon. Ensuite, tournez le bouton d’intensité à la position désirée pour contrôler l’intensité de l’excitation de la lampe à large bande.
Cliquez sur La barre d’échelle Show/Hide pour ajouter une barre d’échelle à l’image de microscopie optique en champ lumineux du cristal et observer une image du cristal sous un éclairage uv complet ou confiné. Pour choisir entre l’éclairage confiné ou un éclairage à champ large, utilisez le bâton et les boutons pour ajuster la taille de l’ouverture du champ de lampe UV. Sous l’onglet SpectraPro SP 2300, sélectionnez une longueur d’onde pour observer l’émission de l’échantillon et ajuster le temps d’exposition du détecteur.
Pour obtenir le cube hyperspectral dans le séquenceur, cliquez plus pour ajouter un nouveau nœud et cliquez sur Confocal Imager. Cliquez sur Acquisition multi-spectre et entrez les nombres de position X et Y souhaités, ainsi que la taille d’étape souhaitée. Sélectionnez l’option matérielle pour la synchronisation de la caméra et pour la cartographie des émissions visibles, et cliquez bien.
Dans le séquenceur, cliquez sur la ligne d’acquisition multi-spectre nouvellement ajoutée pour mettre en surbrillance le nœud et cliquez sur Lire pour exécuter le nœud sélectionné. Pour l’analyse des données d’imagerie hyperspectrale capturées, par exemple, pour une distribution spectrale d’une image, dans le menu Traitement, sélectionnez Données et Culture et Bend pour augmenter le rapport signal/bruit de l’image. Pour un profil d’intensité d’émission, cliquez à droite sur l’image du cube et sélectionnez Créer X-Profile pour l’analyse d’une ligne.
Faites glisser pour sélectionner la zone et cliquez à droite sur la région d’intérêt. Pour sélectionner Ajouter au graphique. Afficher l’intensité des émissions en fonction de la position physique de la cible.
Le profil d’intensité apparaîtra dans le nouveau graphique. Pour obtenir un spectre d’émission d’une zone spécifique de l’échantillon, passez le curseur au-dessus de l’image du cube, cliquez à droite et cliquez sur Sélection rectangle. Faites glisser et cliquez pour dessiner la forme de sélection sur la région désirée.
Cliquez ensuite à droite sur la région d’intérêt et sélectionnez Ajouter la sélection au graphique. Dans la fenêtre Ajouter au graphique, sélectionnez Créer un nouveau graphique pour afficher les spectres d’émission de la cible et cliquez bien. Enregistrez ensuite le spectre acquis avant de sélectionner une nouvelle région.
Ici, une image de champ lumineux d’un cristal enregistré après avoir ajusté l’échantillon dans la mise au point appropriée est montrée. La morphologie en forme d’aiguille du cristal peut être clairement observée. Ici, des images du même cristal sous excitation UV avec éclairage complet ou éclairage confiné localement peuvent être observées.
L’éclairage confiné peut être utilisé pour étudier les effets du transfert d’énergie ou de lumière dans le cristal qui peuvent déclencher un comportement de guide d’ondes. Par exemple, dans cette image, une forte émission est détectée dans un point qui n’est pas directement sous excitation, ce qui suggère qu’une migration efficace de l’énergie a lieu à travers le cristal. À partir du cube hyperspectral acquis, il est également possible d’obtenir la distribution spectrale sous la forme d’une image, représentant une longueur d’onde spécifique.
Le profil d’intensité d’une longueur d’onde d’émission spécifique et les spectres d’émission à n’importe quel pixel ou zone du cube hyperspectral acquis. Par exemple, les spectres d’émission de cette analyse montrent les bandes d’émission les plus caractéristiques de l’ion europium. En outre, le profil spatial le long des différentes faces cristallines indique une émission plus lumineuse à la pointe et les faces latérales et peut être corrélé avec les distances d’ion lanthanide/lanthanide dans les trois directions spatiales.
Pour obtenir un bon signal dans un temps d’enregistrement raisonnable du cube hyperspectral, il est important d’ajuster les configurations du microscope, la mise au point et le temps d’exposition au détecteur. Émissions excitation UV et émission visible, cette technique peut être effectuée en utilisant l’excitation proche infrarouge et la détection des émissions dans le proche infrarouge. Cela lui permet d’être applicable pour un large éventail de matériaux luminescents.
La corrélation des signaux optiques avec un éventail de caractéristiques dépendantes rend cette technique très intéressante pour l’étude des relations structure/propriété, y compris l’évaluation in vitro des interactions nano-bio.
