Ce protocole est utile pour déterminer des changements dans l’activation de NF-kappa-B dans les cellules exprimant un journaliste de luciferase de NF-kappa-B. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un écran à haut débit de facteurs ou de conditions qui conduisent à des changements dans l’activation NF-kappa-B. NF-kappa-B est un facteur de transcription pour une grande variété de processus cellulaires.
Une fonction bien connue de NF-kappa-B est dans l’induction des réponses inflammatoires en induisant l’expression de diverses cytokines et chimiokines. Notre laboratoire s’intéresse particulièrement à l’induction du NF-kappa-B induit par l’agent pathogène Salmonella typhimurium. Ici, nous utilisons la ligne cellulaire HeLa qui est habilement transfected avec un journaliste NF-kappa-B luciferase plasmide.
D’autres bactéries, ou même des virus ou des composés chimiques, peuvent être utilisées dans cette lignée cellulaire pour étudier l’activation du NF-kappa-B. D’autres lignées cellulaires peuvent également être utilisées si vous pouvez introduire un tel nf-kappa-B luciferase reporter plasmide dans cette lignée cellulaire. Quelqu’un qui fait cela pour la première fois peut avoir des problèmes correctement en utilisant la technique stérile qui est nécessaire pour la culture cellulaire et le travail bactérien.
Un jour avant la stimulation cellulaire, enlever le média de croissance des cellules HeLa 57A qui ont été cultivées à environ 75% confluency. Laver les cellules avec un millilitre de 0,05% trypsine EDTA. Remplacer par un autre millilitre de trypsine EDTA et transférer le flacon dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Après que les cellules ont été détachées du flacon, suspendez-les en 10 millilitres de supports de croissance. Combinez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu Trypan, pipette de haut en bas pour mélanger, et transférer 10 microlitres sur une diapositive de comptoir cellulaire. Comptez les cellules en suspension à l’aide d’un compteur cellulaire, et utilisez un média de croissance pour diluer les cellules à une concentration finale de 2,5 fois 10 à cinq cellules par millilitre dans un tube conique de 50 millilitres.
Transférer 250 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 48 puits. Capuchon périodique et retourner le tube conique pour assurer une suspension cellulaire homogène. Appuyez doucement sur la plaque sur le côté pour vous assurer que les cellules se répartir uniformément dans les puits.
Transférer la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % et permettre aux cellules de se fixer et de croître pendant la nuit. Stries congelées stocks de Salmonella sur les plaques d’agar LB pour produire des colonies simples. Transférer les plaques dans un incubateur fixé à 37 degrés Celsius et permettre une croissance pendant la nuit.
Le lendemain, ajouter trois millilitres de LB aux tubes stériles de culture bactérienne, et ajouter des antibiotiques appropriés aux médias. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, choisissez une seule colonie parmi les cultures bactériennes striées et touchez la boucle au média LB. Capuchon des tubes après l’inoculation et jeter la boucle.
Placez les tubes dans un incubateur secouant fixé à 37 degrés Celsius et 180 RPM, puis laissez les bactéries se développer pendant la nuit. Le matin, récupérez les cultures bactériennes nocturnes de l’incubateur. Préparer les tubes à la sous-culture en ajoutant trois millilitres de LB frais et d’antibiotiques.
Transférer 30 microlitres de la culture bactérienne de nuit vers les médias fraîchement préparés. Placez les tubes dans un incubateur secouant fixé à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation de trois heures, transférer un millilitre de bouillon LB stérile dans une cuvette en plastique pour servir de blanc.
Transférer 900 microlitres de LB dans les autres cuvettes qui seront utilisées pour l’analyse de l’échantillon. Transférer 100 microlitres de sous-culture bactérienne dans une cuvette contenant 900 microlitres de LB, et pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour mélanger. Répétez cette demande pour chaque suspension bactérienne.
Allumez le spectrophotomètre pour mesurer la densité optique des cultures bactériennes à une longueur d’onde de 600 nanomètres. Placez le blanc dans le spectrophotomètre. Prenez note de l’orientation.
Fermez le couvercle et appuyez sur le bouton blanc sur le spectrophotomètre pour obtenir l’absorption de fond. Remplacez la cuvette vierge par un échantillon de cuvette dans la même orientation et appuyez sur lire. Enregistrez les valeurs OD600 de ces échantillons.
Multipliez la valeur par 10 pour tenir compte du facteur de dilution. Diluer la suspension un à dix dans une cuvette et mesurer l’absorption, ce qui devrait donner une valeur d’environ 0,1 qui correspond approximativement à une fois 10 à la CFU neuf par millilitre. Dans un nouveau tube, ajouter un volume approprié de la sous-culture diluée à la LB fraîche pour obtenir une suspension d’une fois 10 à la CFU huit par millilitre à utiliser comme inoculum.
Préparer les dilutions en série de l’inoculum en transférant 50 microlitres de suspension bactérienne à un tube contenant 450 microlitres de PBS stérile jusqu’à ce qu’une dilution finale d’environ 100 CFU par millilitre soit faite. Transférer 100 microlitres des deux dilutions les plus basses, 100 et 1000 CFU par millilitre, à deux plaques d’agar LB, et étendre la suspension à l’aide d’un épéiste cellulaire pour obtenir des colonies individuelles. Transférez ces plaques dans un incubateur de 37 degrés Celsius et incubez pendant la nuit.
Le lendemain, comptez les colonies et calculez la concentration bactérienne de l’inoculum initial pour déterminer la concentration réelle d’inoculum. Le même jour, étiquetez le couvercle de la plaque en fonction des conditions d’infection qui seront utilisées pour chaque puits, chaque condition étant effectuée en triplicate. Ajouter 10 microlitres de l’inoculum aux puits appropriés et ajouter 10 microlitres de LB stériles aux puits de contrôle non infectés.
Pour synchroniser le temps d’infection, placez la plaque dans une centrifugeuse de table et tournez à 500 fois G pendant cinq minutes, en veillant à ce que la plaque soit contrebalancée. Ensuite, transférez les cellules infectées dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius pendant une heure. Placez un tube conique de 15 millilitres contenant un aliquot de la culture cellulaire dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour une utilisation dans l’étape suivante.
Une heure après le moment de l’infection, retirez le tube conique de 15 millilitres contenant des supports de culture cellulaire du bain d’eau et essuyez l’extérieur avec 70 % d’éthanol. Transférer les plaques de culture tissulaire de l’incubateur à une armoire de biosécurité. Utilisez des pointes stériles pour aspirer les médias des puits et remplacer par 250 microlitres de médias de culture cellulaire fraîche et chaude.
Retournez les plaques à l’incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant quatre heures supplémentaires. Après cela, retirez les plaques de l’incubateur de dioxyde de carbone et aspirez les médias des puits. Pour l’analyse de la luciferase, ajouter 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire 1X aux puits.
Transférer la plaque dans un congélateur négatif de 80 degrés Celsius et incuber pendant au moins 30 minutes pour assurer une lyse cellulaire efficace. Ensuite, placez la plaque contenant du lysate de cellules congelées sur un banc pour décongeler, et préparez des réédagents de substrat de luciferase selon les recommandations du fabricant. Laisser les réénages de substrat de luciferase s’équilibrer à température ambiante.
Ensuite, allumez le lecteur de plaque et ouvrez le programme de lecteur correspondant. Réglez la machine pour mesurer la luminescence. Transférer 10 microlitres de chaque cellule lysate dans un puits d’une plaque opaque de 96 puits.
À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 50 microlitres du reagent d’analyse de luciferase à chaque puits de la plaque opaque. Appuyez doucement sur la plaque sur le côté pour mélanger les puits et assurez-vous que la surface inférieure est recouverte de liquide. Placez la plaque dans un lecteur de plaque et initiez la lecture.
Copiez les valeurs de luminescence dans un programme de feuille de calcul et tracez les résultats. Ce protocole se concentre sur l’activation du facteur de transcription NF-kappa-B à l’aide d’un journaliste de luciferase dépendant du NF-kappa-B qui est habilement transfecté en une lignée de cellules HeLa. Ce chiffre montre une expérience représentative de l’activation dépendante de la luciferase NF-kappa-B et de l’expression du gène IL6 dans les cellules HeLA 57A infectées par les souches de salmonella typhimurium.
L’infection par la souche de type sauvage SL1344 a induit un signal de luciferase fort dans l’expression RLU et IL6, qui a été diminuée dans les cellules infectées par le triple mutant sipA sopB sopE2 et réduite à des niveaux de contrôle avec le quadruple mutant sipA sopB sopE2 sopE. Portez une attention particulière lorsque vous faites vos dilutions et placages en série. Cela vous assurera d’avoir un inoculum cohérent à travers vos souches.
Après avoir identifié les facteurs qui contribuent à l’activation du NF-kappa-B et aux changements en aval de l’expression de l’ARNm, la technique des taches occidentales peut être utilisée pour identifier les changements dans l’expression des protéines. Ce protocole a permis à notre laboratoire non seulement d’évaluer l’activation du NF-kappa-B induite par Salmonella, mais aussi d’autres composés et protéines impliqués dans l’activation du NF-kappa-B. Salmonella typhimurium est un agent pathogène humain.
Employez le PPE approprié en travaillant avec ces bactéries.
