Ce protocole nous permet d’examiner le cycle cellulaire au niveau de la cellule unique à l’aide du cytomètre de masse, ce qui permet de réaliser plusieurs nouvelles recherches et études cliniques. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité. L’IdU est ajouté directement aux cellules et il n’y a pas besoin de traitement supplémentaire ou d’anticorps.
Nous avons utilisé cette technique pour étudier l’état du cycle cellulaire chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë dans les compartiments des cellules souches et progénitrices. Et cela a démontré que les propriétés du cycle cellulaire de ces types de cellules spécifiques peuvent être corrélées avec les résultats cliniques des patients atteints de ces maladies. Cette technique peut être utile pour comprendre les propriétés de croissance des cellules cancéreuses rares et comprendre la prolifération des sous-ensembles de cellules immunitaires.
Avant et après l’ajout d’IdU aux échantillons cellulaires, maintenir les cellules dans les conditions de croissance d’intérêt. Dans ce cas, un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius à 5% de CO2 pour marquer les cellules avec IdU, dilue la solution mère concentrée d’IdU un à 50 dans le milieu de croissance des cellules. Ensuite, transférez les échantillons dans une hotte de biosécurité et ajoutez 10 microlitres d’une IdU millimolaire à chaque millilitre de cellules.
Remettre les cellules dans l’incubateur pendant 10 à 15 minutes avant de transférer les échantillons dans des tubes coniques individuels. Recueillir les cellules par centrifugation dans des tubes coniques de 15 millilitres et remettre les pastilles en suspension dans 200 microlitres de PBS par tube. Si nécessaire, étiquetez les cellules avec une coloration vivante / morte appropriée pour marquer les cellules mortes.
Après coloration vivante / morte, tremper les cellules avec un support lavé avec CSM avant de fixer les cellules avec 25 microlitres de paraformaldéhyde à 16%. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, recueillir les cellules par centrifugation. Ajouter cinq à 15 millilitres de CSM et centrifuger à nouveau.
Remettez les pastilles en suspension dans 500 microlitres de milieu de coloration cellulaire supplémenté en 10% de diméthylsulfoxyde. Ensuite, transférez les cellules dans des tubes plus petits pour les stocker dans des températures négatives de 80 degrés Celsius. Pour normaliser l’analyse du cycle cellulaire, importez les fichiers dans un logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié et créez un tracé biaxial de la longueur de l’événement par rapport à 191 iridium.
Les cellules formeront une population distincte d’iridium brillant. Modifiez l’échelle de longueur de l’événement pour rendre les cellules plus visibles. Créez ensuite une porte singulet pour exclure 50 à 60% des doublets et des débris et définissez les paramètres gaussiens résiduels et décalés pour éliminer les doublets et débris restants.
Pour définir la porte de phase S, créez un graphique biaxial d’IdU par rapport à un marqueur de prolifération. Les cellules IdU positives en phase S formeront une population distincte. Pour les points de contrôle G0/G1 et G2/M, établissez les points de contrôle sur un tracé IdU par rapport à Cyclin B1.
La phase G0/G1 sera Cyclin B1 faible, IdU négative, et la phase G2/M sera Cyclin B1 élevée, IdU négative. Pour ouvrir la porte à des types de cellules spécifiques, tracez uniquement les cellules de phase S sur le graphique Cyclin B1 versus IdU pour aider à établir la séparation entre les cellules de phase G0/G1 et de phase G2/M. Dessinez une porte autour de la forte population de Cyclin B1.
Dans certains cas, cela peut être difficile à discerner, mais le niveau de cycline B1 d’environ 5% supérieurs de la population en phase S est généralement le point de rupture entre les portes de phase G0 / G1 et G2 / M. Les cellules résidant dans la porte précédente seront la population de phase G2/M, tandis que le reste sera la population de phase G0/G1. Pour établir la population en phase G0, créer un diagramme de la protéine du rétinoblastome phosphorylé par rapport à l’IdU.
La phase G0 sera représentée par une population de protéines de rétinoblastome phosphorylées faible, IdU négative. Comme la population active en cycle démontrera une protéine de rétinoblastome phosphorylée élevée et une incorporation d’IdU, la porte de phase G0 peut être dessinée sur cette limite car elle s’exprime généralement à deux populations distinctes. Si la porte G0 est difficile à définir, faire de la population de phase S la population active et dessiner une porte incorporant les 90 à 100% supérieurs de la population élevée de protéines de rétinoblastome phosphorylée.
La faible population de la protéine du rétinoblastome phosphorylée à l’extérieur de la porte est généralement la population G0, tandis que les cellules G0 / G1 avec des niveaux de pRb qui tombent dans cette porte sont des cellules G1. Pour le gating en phase M, créer une IdU par rapport à l’histone phosphorylée H3 par tracé axial. La phase M sera observée comme la très petite fraction de cellules au sein de la population d’histones H3 phosphorylées.
Les cellules de la population G2/M présentant des niveaux plus faibles de pHH3 sont les cellules G2. Si l’incorporation de l’IdU a échoué ou n’a pas été possible, définir les fractions cellulaires cycliques et non cycliques à l’aide de Ki67 et de la protéine du rétinoblastome phosphorylée. La population doublement positive représentera la population cycliste active corrélée aux phases G1, S, G2 et M.
La population doublement faible représentera la population non cyclique corrélée à la phase G0. Une fois que toutes les portes ont été établies, exportez les valeurs numériques des portes. Les pourcentages de chaque cycle peuvent être obtenus en soustrayant les populations individuelles des populations combinées pour générer des valeurs numériques pour chaque phase individuelle du cycle cellulaire pour une représentation graphique et une analyse statistique ultérieures.
L’établissement de la porte singulet est important pour séparer les débris cellulaires et les doublets afin de permettre l’isolement de la population unicellulaire. L’analyse du cycle cellulaire des cellules individuelles peut ensuite être effectuée. Le marquage IdU et donc l’analyse du cycle cellulaire en aval peuvent être considérablement affectés par le temps et la température.
Par exemple, les cellules qui restent trop longtemps dans des récipients fermés ou dans le transport entre des endroits auront des fractions de phase S réduites et cela ne sera pas précis pour l’analyse du cycle cellulaire. Les échantillons de cellules conservés pendant de courtes périodes d’une heure ou moins démontrent toujours une distribution normale du cycle cellulaire, ce qui indique qu’un transport rapide peut ne pas avoir d’impact négatif sur l’analyse. Les cellules cryoconservées peuvent nécessiter une longue période d’équilibrage avant de revenir au cycle cellulaire actif, ce qui peut encore ne pas refléter l’état du cycle cellulaire pré-cryoconservation.
Différents types de cellules peuvent également être affectés différemment par les conditions d’entretien. Par exemple, dans cet échantillon de moelle osseuse humaine, les lymphocytes T ont démontré une réduction du nombre de cellules par rapport aux monoblastes du même échantillon. Un autre avantage de la cytométrie de masse est la capacité de discriminer les cellules dans l’arrêt du cycle cellulaire ou qui ont une distribution anormale du cycle cellulaire.
Un avantage majeur de cette technique est qu’elle est facilement compatible avec d’autres mesures de cytométrie de masse telles que le phénotypage de surface, la structure de la chromatine, le stimulation intracellulaire des cytokines, qui peuvent être corrélées avec l’état du cycle cellulaire. Nous avons utilisé cette technique pour étudier l’épuisement des cellules immunitaires, la sénescence, et pour montrer que la réponse à la chimiothérapie chez les patients atteints de leucémie aiguë peut être corrélée avec les propriétés du cycle cellulaire des cellules leucémiques.
