Ici, nous démontrons comment utiliser le capteur FRET sensible à l’ATP ATeam 1.03 YEMK pour des mesures dynamiques des changements dans les niveaux neuronaux et astrocytiques ATP dans organotypically cultivés tranches hippocampal souris. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut étudier le métabolisme énergétique dans le tissu cérébral vivant dans un cadre contrôlé, un environnement avec des niveaux élevés d’expression des capteurs. Cette technique peut aider à obtenir un aperçu des pathomécanismes, des maladies sous-jacentes, ou des lésions cérébrales, par exemple, causées par la privation d’énergie, comme l’AVC ischémique.
Il peut, en principe, être utilisé pour étudier les niveaux d’ATP, non seulement dans les tissus cérébraux, mais aussi dans d’autres organes. Pour mener à bien cette expérience, il est essentiel d’effectuer toutes les étapes impliquées dans la culture du tissu extrêmement prudent et de maintenir la stérilité. De plus, une certaine connaissance de l’imagerie fluorescente cellulaire est requise.
La manipulation des tissus dans l’approche la plus sophistiquée et une visualisation est essentielle pour comprendre les procédures appropriées. Il en va de même pour les expériences d’imagerie. Rodrigo Lerchundi, postdoc, et Na Huang, étudiant en master du laboratoire, démontreront la procédure.
Dans une boîte de Pétri glacée remplie d’ACSF, placez le cerveau sur une membrane filtrante. Séparez les hémisphères et effectuez une coupe parasagittale à un angle de 45 degrés. Fixez un hémisphère au stade du tissu vibratome avec du superglue, et transférez immédiatement le bloc tissulaire au bain vibratome contenant de l’ACSF glacé bouillonné de 5 % de dioxyde de carbone et de 95 % d’oxygène.
Aligner le tissu dans le bain vibratome. Gardez le deuxième hémisphère dans l’ACSF glacé jusqu’à ce qu’il soit trafiquis. Réglez le vibratome pour couper les tranches de 250 à 400 micromètres.
Après avoir coupé la tranche, identifier la formation hippocampale en fonction de son apparence morphologique typique et l’isoler à l’aide d’aiguilles hypodermiques, en gardant la partie du cortex cérébral adjacente à l’hippocampe. Placer la tranche sur un maillage dans l’ACSF, réchauffée à 34 degrés Celsius et bouillonnée de 5 % de dioxyde de carbone et de 95 % d’oxygène jusqu’à ce que toutes les tranches soient récoltées. Transférer les tranches dans l’armoire d’écoulement laminaire pour continuer dans des conditions stériles.
Avec une pipette Pasteur en verre inversée, stérile, transférez délicatement les tranches de l’ACSF dans l’une des boîtes de Petri préchauffées remplies de solution stérile hanks’salt. Changer la pipette et transférer les tranches dans le deuxième plat de culture. Répétez le processus cinq fois dans l’ensemble.
Transférez le moins de HBSS possible aux plaques de culture suivantes. À l’aide d’une pipette, placer délicatement une tranche à la fois sur le dessus de l’insert culturel. Évitez les turbulences dans la pipette et attendez que la tranche descende jusqu’à l’extrémité de la pipette Pasteur.
Répétez le processus pour chaque tranche. Déposer deux tranches sur une membrane. Retirez soigneusement toute solution Hank excédentaire du haut de l’insert en utilisant une pointe fine.
Gardez les cultures dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius jusqu’au jour de l’expérience. Remplacer le milieu tous les deux à trois jours. Sans toucher le tissu, appliquer 0,5 microlitre du vecteur dilué directement sur le dessus de chaque tranche.
Enfin, remettre les tranches dans l’incubateur et les entretenir pendant au moins six jours de plus. Juste avant de commencer une expérience, transférez un insert contenant des tranches de culture dans le capot stérile, et placez-le dans un plat de 30 millimètres contenant un millilitre de milieu de culture de tranche organotypique, ou un milieu essentiel minimal. Placez le plat sous le stéréoscope et concentrez-vous sur la surface de la tranche.
Utilisez deux aiguilles hypodermiques stériles pour faire une courte coupe transversale à droite sur les bords étroits d’une tranche choisie, et dans la couche supérieure sans endommager le tissu en dessous. Pour retirer la tranche préparée de l’insert, maintenez les bords de la membrane à l’aide d’une pince à épiler et utilisez un scalpel stérile pour faire des coupes droites et parallèles à la membrane, formant un carré ou un triangle avec la tranche au centre. Si l’insert héberge des tranches supplémentaires, transférez-les dans la plaque d’origine et dans l’incubateur.
La tension de surface du milieu empêchera sa fuite sur la surface de la membrane. Préparez l’ACSF expérimental et obtenez un pH de 7,4 en le bouillonnant avec 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone grâce à un tube inséré relié à l’approvisionnement en carbogen pendant au moins trente minutes. Gardez la solution saline à bulles pendant toute l’expérience.
Ensuite, allumez la source de lumière fluorescente du monochromètre. Transférer la culture de la tranche organotypique dans la chambre expérimentale. Placez une grille sur le dessus de la culture de tranche organotypique avec le cadre vers le bas, ne touchant pas la culture, et les fils vers le haut, touchant la membrane.
Placez la chambre au microscope et connectez-la au système de perfusion. Allumez la pompe périssaltique à un débit de 1,5 à 2,5 millilitres par minute. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite du système de perfusion.
À l’aide de la lumière de transmission, mettre la tranche de culture au point et identifier la zone où les expériences doivent être effectuées. Avant de commencer les expériences d’imagerie, attendez au moins 15 minutes pour permettre aux tranches de s’adapter aux conditions salines, puis allumez la caméra et le logiciel d’imagerie. Exciter la protéine fluorescente donneur à 435 nanomètres.
Réglez le temps d’exposition entre 40 et 90 millisecondes. Insérez ensuite le miroir dichroïque et les filtres dans l’unité du séparant du faisceau. Divisez l’émission de fluorescence à 500 nanomètres avec un séparateur d’image d’émission, et employez des filtres de passage de bande à 482 plus ou moins 16 et 542 plus ou moins 13,5 nanomètres pour isoler davantage la fluorescence de donneur et d’accepteur.
Choisissez une région d’intérêt apparemment dépourvue de fluorescence cellulaire pour la soustraction de fond. Entourez les structures simples des tissus étiquetés dans l’image à l’écran pour créer des ROM. Définissez la fréquence de l’acquisition d’images et le temps d’enregistrement global.
Pour les expériences de plus de 30 minutes, une fréquence d’acquisition de 0,2 à 0,5 Hertz est recommandée pour prévenir la phototoxicité. Par la suite, commencez l’enregistrement. Pour induire des changements dans l’ATP intracellulaire, passez du tube de perfusion de l’ACSF standard à une solution saline contenant des inhibiteurs métaboliques, par exemple, la solution chimique d’ischémie.
Alternativement, utilisez une solution saline avec une concentration élevée de potassium à huit millimolaires pour imiter la libération de l’ion de potassium des neurones actifs. Directement après les enregistrements, échangez l’ACSF expérimental avec un ACSF tamponné en tas. Ensuite, transférez la chambre d’enregistrement contenant la culture de la tranche au microscope à balayage laser confocal.
Prenez des images de pile Z à la résolution Z la plus élevée possible à la configuration optique donnée. Dans ce protocole, dix jours après une transduction, des neurones exprimant ATeam 1.03 YEMK ont été trouvés à haute densité dans le néocortex des tranches de tissu cultivés à des profondeurs de jusqu’à 50 micromètres sous la surface de tranche. Des résultats comparables ont été obtenus dans l’hippocampe.
Pour les astrocytes, ATeam 1.03 YEMK a été exprimé sous le contrôle du promoteur acide fibrolary humain de protéine acide, et les tranches organotypiques exprimant ATeam 1.03 YEMK dans les neurones hippocampal choisis ROIs représentent le somata des cellules pyramidales. Après avoir exposé la tranche à un azide de sodium de 5 millimlaires en l’absence de glucose extracellulaire pendant une minute, des changements opposés ont été induits dans l’intensité d’émission de la paire FRET. Une diminution réversible du ratio FRET ATeam a également été observée.
Le rapport fret ateam à long terme dans 14 cellules différentes dans des conditions de base dans les neurones et les astrocytes montrent que l’ATeam est un capteur fiable et stable. Veuillez noter que l’ischémie chimique a entraîné la forte baisse prévue du rapport ATeam dans les deux types de cellules à la fin de cette expérience. Une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium de trois à huit millimolar pendant trois minutes n’a pas eu comme conséquence un changement détectable dans les neurones exprimant ATeam 1.03 YEMK.
En revanche, les astrocytes ont réagi à l’augmentation du potassium extracellulaire par une augmentation réversible du rapport ATeam FRET, indiquant une augmentation des niveaux intracellulaires d’ATP. Encore une fois, l’ischémie chimique a causé une diminution immédiate du rapport ATeam, démontrant que le capteur peut détecter des changements dans l’ATP. Lorsque vous essayez l’imagerie cellulaire basée sur fret tel que décrit ici, il est important de garder à l’esprit que la production de tranches de haute qualité dans les cultures organotypiques est une étape clé.
En outre, l’enlèvement soignel de la cicatrice glial et l’imagerie expert-niveau sont exigés. Après cette procédure, on devrait également être en mesure d’effectuer une expérience incorporant différents autres nanocapteurs à base de FRET pour les métabolites cellulaires. Par exemple, ceux pour le glucose ou le lactate.
Enfin, il faut souligner que les actes pertinents de protection des animaux doivent toujours être observés. Cela est également vrai pour les lois efficaces régissant la manipulation des organismes génétiquement modifiés.
