La culture des fibroblastes dans le tissu tumoral sphéroïde récapitule beaucoup mieux que le système 2D couramment utilisé sur le plastique rigide. Il permet d’étudier la différenciation des fibroblastes dans un environnement tumoral. Dans cette méthode, la rigidité du travail plastique de culture cellulaire n’influence pas artifactually la différenciation de fibroblaste.
Au lieu de cela, l’influence de l’interaction de matrice cellulaire sur la différenciation induite par tumeur du fibroblaste peut être analysée in vitro. Pour commencer cette procédure, obtenir le média de culture cellulaire, qui est MEM complété par 1% de chaleur inactivée FBS et 1% streptomycine pénicilline. En outre, obtenir une solution de méthylcellulose de six milligrammes par millilitre.
Mélanger une partie de la méthylcellulose avec trois parties du média de culture cellulaire pour préparer la solution de formation sphéroïde. Resuspendez les fibroblastes normaux immortalisés fraîchement décongelés ou d’autres types de cellules énumérés dans le protocole de texte dans la solution de formation sphéroïde. Si des cytokines ou des inhibiteurs de l’intégrine sont inclus dans l’étude, ajoutez ces composés à la suspension cellulaire afin de les insérer dans les sphéroïdes pendant leur formation.
Le cas échéant, ajouter des composés inhibiteurs ainsi que 10 nanogrammes par millilitre de bêta TGF un pour déclencher la différenciation dans les fibroblastes normaux immortalisés. Répartir 100 microlitres de la solution de formation sphéroïde dans chaque puits d’une plaque ronde de 96 puits multiples. Pipette la solution dans chaque puits de haut en bas à plusieurs reprises pour mélanger.
Ensuite, incuber la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour permettre à un sphéroïde de se former dans chaque puits. Tout d’abord, couper l’extrémité d’une pointe pipette pour agrandir l’orifice. Une fois l’incubation terminée, utilisez cette pipette coupée pour recueillir les sphéroïdes dans un tube de réaction de 1,5 millilitre par condition expérimentale ou par protéine à analyser.
Centrifugeuse les sphéroïdes à 1000 fois G pendant environ 30 à 60 secondes. Retirez soigneusement la méthylcellulose contenant du supernatant en pipetage en vous assurant de ne pas déranger les sphéroïdes granulés. Un soin particulier doit être pris lors du transfert des sphéroïdes vers les tubes de réaction.
Assurez-vous que vous n’avez pas de forces de dérive de cailles en coupant la pointe. Il est également important que vous collectiez tous les sphéroïdes. Pendant l’étape de lavage, assurez-vous de ne pas perdre les sphéroïdes par aspiration.
Pour laver les sphéroïdes ajouter 50 microlitres d’un X PBS. Centrifugeuse à 1000 fois G pendant 30 à 60 secondes. Retirez ensuite soigneusement le PBS par pipetting.
Selon la protéine à tachée, fixer les sphéroïdes soit avec 50 microlitres de 4%paraformaldéhyde et PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez les sphéroïdes avec PBS comme décrit précédemment. Perméabilizez les cellules avec 0,1% triton X et PBS pendant quatre minutes à température ambiante.
Ensuite, lavez les sphéroïdes dans PBS trois fois comme décrit précédemment. Ajoutez du PBS contenant 5 % de FBS et 2 % de BSA aux sphéroïdes et incubez à température ambiante pendant une heure pour bloquer les sites d’interaction protéique non spécifiques. Maintenant, incuber les sphéroïdes avec 30 microlitres d’anticorps primaires et PBS avec 2,5%FBS et 1%BSA à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, lavez les sphéroïdes dans PBS trois fois comme décrit précédemment. Après cela, incuber les sphéroïdes avec 30 microlitres d’anticorps secondaires et PBS avec 2,5%FBS et 1%BSA à température ambiante pendant 90 minutes. Lavez les sphéroïdes dans PBS trois fois comme décrit précédemment.
Ensuite, incubez les cellules avec 30 microlitres de solution de coloration Dappy pendant quatre minutes à température ambiante. Lavez les sphéroïdes dans PBS une fois comme décrit précédemment. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, déposer les sphéroïdes sur une glissière en verre et une goutte de PBS.
Utilisez un microscope à balayage laser pour imager les sphéroïdes par microscopie par fluorescence à un grossissement de 10 fois. Prenez différentes sections optiques transversales du sphéroïde à différentes plaines optiques de la pile Z. Une image représentative de la coloration immunofluorescente des sphéroïdes homo des fibroblastes pancréatiques normaux comparés aux sphéroïdes homo des fibroblastes associés au cancer immortalisé montre un signal accru pour l’alpha trois sous-unité dans les cellules différenciées.
Le signal de fluorescence des cellules dans le sphéroïde sont ensuite quantifiés avec les images de pile Z du sphéroïde 3D et les niveaux transcriptionnels du gène intégrateur alpha trois sous-unité sont déterminés par qPCR. Tous ces résultats démontrent que l’intégrine alpha trois est upregulated dans les fibroblastes associés au cancer immortalisé par rapport à la contrepartie normale. Cela prouve que l’intégrine alpha trois bêta on peut être considéré comme un marqueur pour la différenciation des fibroblastes pancréatiques.
Cette méthode est idéale pour capituler les tissus auto généralement trouvés dans les organes et les masses cancéreuses où la rigidité de la matrice cellulaire supplémentaire détermine le sort cellulaire. La culture sphéroïdes est un modèle polyvalent qui peut être combiné avec d’autres analyses après la dissociation sphéroïde comme la quantité en temps réel PCR et la cytométrie complète. Le paraformaldéhyde utilisé pour la fixation des sphéroïdes est un agent chimique dangereux.
Les gants et les lunettes doivent être portés pour se protéger.
