L’amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique des mammifères et un outil puissant pour identifier les populations cellulaires critiques et les mécanismes qui contrôlent la régénération endogène. Le modèle P3 permet l’identification des populations de cellules blastémales précoces et tardives, l’étude de la revascularisation pendant la régénération, et l’étude de l’ossification intramembranous sans besoins complexes de dispositif de stabilisation osseuse. Oussama Qureshi, Alyssa Falck et Katherine Zimmel, technicienne, et Regina Brunaeur, professeure adjointe de recherche de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec moi.
Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds chez une souris CD-1 de huit à 12 semaines, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et placez la souris sous un microscope à dissection de 10 X. Utilisez de l’iode chirurgical de povidone et 70% d’éthanol pour stériliser les chiffres de chaque membre postérieur et utilisez des microscisseurs pour couper les cheveux loin du site chirurgical. Appliquer localement un microlitre de bupivacaine topique pour anesthésier le site chirurgical, et jouer doucement une patte arrière pour exposer la surface des chiffres médiaux.
Puis en tenant le scalpel à un angle parallèle à la garniture de graisse, utilisez un scalpel stérile numéro 10 pour amputer la pointe distale de la phalange terminale des chiffres deux et quatre. Appliquez localement un microlitre supplémentaire de bupivacaine sur chaque chiffre amputé et retournez la souris dans une cage propre pour permettre aux plaies de guérir sans pansement et avec surveillance jusqu’à ce qu’elles soient complètement récumbency. Pour assurer un plan d’amputation P3 réussi, maintenez le scalpel parallèle à la graisse pendant l’amputation et effectuez le balayage de micro-CT pour confirmer la longueur correcte d’amputation.
Au point de terminaison expérimental approprié, utilisez un scalpel pour couper le chiffre à mi-chemin à travers l’os de phalange moyenne à peu près le deuxième tampon de graisse ventrale indent. Transférer le tissu dans un flacon de scintillation de 20 millilitres contenant 10 millilitres de formaline de zinc tamponné frais fixatif pendant 24 à 48 heures. Et utilisez un microtome pour acquérir quatre à cinq sections micromètres d’épaisseur de chaque chiffre, plaçant les tranches dans un bain d’eau de 38 à 41 degrés Celsius complété par une solution adhésive histologique au fur et à mesure qu’elles sont obtenues.
Ensuite, capturez les tranches sur les glissières adhésives et placez les glissières sur un chauffe-glissière de 37 degrés Celsius pour sécher. Lorsque les glissières ont été déparaffinées, plonger les échantillons dans un bocal de coloration d’une solution appropriée de récupération d’antigène, et chauffer les glissières à 95 degrés Celsius pendant 25 minutes en s’assurant que l’ébullition ne se produit pas. À la fin de l’incubation, laissez le bocal arriver à température ambiante et menter les glissières à plat dans une boîte de diapositives en plastique recouverte d’un pouce de profondeur avec du papier de soie humidifié à la base.
Ajouter 100 microlitres de proteinase K préchauré à chaque échantillon. Couvrir chaque toboggan d’une petite bande de parafilm pour s’assurer que les sections ne deviennent pas sèches. Après 12 minutes à 37 degrés Celsius, retirez soigneusement le film de paraffine et égouttez doucement les glissières sur du papier de soie pour éliminer l’excès de solution de blocage.
Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres de la solution d’anticorps primaire d’intérêt à chaque diapositive. Retourner les sites dans la chambre humidifiante recouverte de film de paraffine pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, après avoir lavé les glissières en solution saline tamponnée tris plus TWEEN ou TBST, étiquetez les glissières avec une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation de 45 minutes à température ambiante protégée de la lumière.
À la fin de l’incubation, lavez les glissières dans tbst et laissez-les sécher. Ensuite, utilisez 100 microlitres de support anti-fondu pour placer soigneusement les couvercles sur les glissières séchées et entreposer les glissières à plat à température ambiante pendant la nuit à l’abri de la lumière pour permettre au milieu de montage de sécher. Pour la tomographie micro-calculée séquentielle in vivo ou micro-CT équiper l’imageur micro-CT avec tube pour permettre l’écoulement de l’oxygène dans et hors de la chambre animale micro-CT, en s’assurant que l’oxygène sortant est équipé d’un filtre à charbon activé pour piéger l’isoflurane.
Réglez le Voxelsize à 10,5 micromètres à 55 kilovoltages de pointe et 145 microampes avec 1000 projections par 180 degrés et rotation continue avec un temps d’intégration de 200 millisecondes, ce qui donne un maximum de 213 tranches par balayage. Lorsque le scanner est prêt, placez doucement la souris anesthésiée dans la chambre animale micro-CT avec les chiffres des membres postérieurs disposés en côté ventral d’association plat et étroit vers le haut avec la patte gauche sur le côté gauche et la droite sur le côté droit de la plate-forme de balayage. Appliquez ensuite du ruban chirurgical pour fixer délicatement les chiffres en place.
Appliquez de l’onguent ophtalmique sur les yeux de l’animal avant d’amorcer l’analyse. Après la numérisation, retourner l’animal dans une cage propre avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence, et laisser jusqu’à plusieurs heures pour la reconstruction de l’image micro-CT. Pour l’analyse de l’image osseuse 3D reconstruite, à l’aide du logiciel fourni avec le micro-CT, convertir les fichiers d’image en une série de fichiers DICOM.
Lorsque tous les fichiers ont été convertis, téléchargez la série DICOM dans un seul dossier à l’aide d’un téléchargeur de fichiers par lots dans un navigateur Web. Chargez le plug-in BoneJ dans le dossier plug-in ImageJ. Faites glisser et déposer le dossier de la série de fichiers DICOM dans la barre ImageJ pour ouvrir les fichiers.
Une pile d’images 16 bits affichant toutes les valeurs grises sera ouverte. Pour afficher l’os uniquement, cliquez sur Ajuster l’image et seuil. Faites glisser la barre supérieure du seuil vers l’extrême droite et ajustez la barre inférieure du seuil jusqu’à ce que seul l’os soit mis en évidence en rouge.
La valeur seuil inférieure sera d’environ 10 000 à 13 000 à une intensité maximale du signal de 32 767. Cliquez sur Appliquer et dans la nouvelle boîte de dialogue, cliquez sur Fond noir. Ensuite, cliquez sur OK. Une image huit bits affichant des valeurs en noir et blanc sera générée.
Avec le blanc correspondant à l’os. Dessinez un rectangle autour de l’os P3 pour le sélectionner et dupliquer la pile. Pour générer une image 3D, cliquez sur Plugins et 3D Viewer et utilisez l’outil de sélection à main levée pour encercler l’os à supprimer.
Puis cliquez à droite et sélectionnez Sélection fill pour recadrer tout os inutile de l’image. Pour quantifier le volume osseux du rendu 3D, ouvrez le plug-in BoneJ et sélectionnez Fraction volume. Une fenêtre de résultats apparaîtra et le volume d’os affiché en millimètres coupé en cubes.
Pour quantifier la longueur osseuse du rendu 3D, utilisez l’outil multipoint ImageJ. Pour capturer une image du rendu 3D, cliquez sur Afficher et prendre un instantané. Enregistrez ensuite l’image sous forme de fichier TIF ou JPEG.
Dans ces sections d’images d’une souris adulte régénérant le chiffre de P3 ont été immunotachées avec des anticorps pour visualiser la régénération intramembranous d’os et la formation de blastema au jour six à sept, neuf et 10 post-amputation. Ici, des rendus micro-CT représentatifs des chiffres numérisés avant l’amputation et à divers moments au cours de la régénération avec des repères utilisés pour identifier les mesures de longueur sont montrés. Le modèle de chiffre de souris est un système puissant pour analyser un environnement pro-régénérateur de blessure qui déclenche la formation de blastema une fois amputé à un niveau distal.
Inversement, l’amputation proximale des chiffres sert de système modèle pour étudier l’échec régénérateur ainsi qu’un site pour tester des stratégies pour améliorer la régénération.
