Ce protocole détaille le développement de populations tilling robustes avec une fréquence de mutation élevée par mutagenèse ems dans les petites cultures céréalières. Les populations de TILLING peuvent être utilisées pour la génomique fonctionnelle, ainsi que pour la découverte de gènes spatiaux génétiques avancés dans les petites cultures céréalières. Les populations tilling développées à l’aide de cette technique ont des fréquences de mutation élevées, et ce protocole peut être appliqué à n’importe quel génotype.
La détection de mutation basée sur l’analyse Cel-1 peut être effectuée à l’aide d’équipements de laboratoire de base. L’étape la plus importante consiste à déterminer la concentration optimale de SME. Par conséquent, une courbe de dosage de SME devrait être faite spécifiquement pour la population individuelle.
Pour commencer, tremper 100 graines avec le génotype d’intérêt dans chacun des six flacons de verre de 250 millilitres, contenant 50 millilitres d’eau distillée. Agiter à 100 RPM pendant huit heures à température ambiante pour l’imbibition. Ensuite, dans une hotte de fumée, préparer 50 millilitres de solutions ems de cinq concentrations différentes en mélangeant le liquide EMS et l’eau distillée.
Après l’imbibition, décanter l’eau de cinq flacons. Ajouter 50 millilitres de solution EMS dans chacun des cinq flacons contenant des graines imbibées. Agiter les flacons pendant 16 heures à 75 rPM et à température ambiante.
Maintenant, décanter la solution EMS dans une bouteille de déchets vides et verser les graines traitées sur du tissu à fromage placé sur une bouteille de déchets vides à recueillir séparément pour chaque traitement. Utilisez de l’eau supplémentaire pour aider à verser les graines. En outre, pulvériser plusieurs millilitres de solution d’inactivation ems sur le mur des flacons contaminés.
Et plongez les pointes de pipette usé dans la solution pendant 24 heures. Inactive la solution EMS utilisée en ajoutant un volume de solution d’inactivation ems à traiter pendant 24 heures. À l’aide d’une cravate de torsion, maintenez les graines traitées par le SME à l’intérieur de la toile à fromage et lavez-les sous l’eau courante du robinet pendant deux heures.
Après le lavage, transplantez chaque graine individuellement dans des dresseurs de racines contenant du sol en pot. Cultivez des plantes à 20 à 25 degrés Celsius pendant une période de lumière de 16 heures. Après 15 jours de transplantation, vérifiez les plantes et comptez le nombre de graines qui n’ont pas germé.
Enregistrer les données sur la survie des plantes. Si le taux de survie n’est pas dans les 40 à 60% effectuer une deuxième ronde d’optimisation posologique avec une concentration modifiée jusqu’à atteindre le taux de létalité souhaité de 40 à 60%Après l’expérience de mutagenèse, recueillir le tissu folilaire des plantes M2 dans une boîte de collecte de tissus 96 puits. Les tissus sont prélevés sur les plantes M2 qui ont été cultivées à partir de plantes M1 auto-autonomes.
Une plante M2 est montrée à partir de chaque plante M1. Extraire l’ADN à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN végétaux avec un système de purification de l’ADN suivant les recommandations du fabricant. Ensuite, chargez deux microlitres de l’extrait d’ADN dans des plaques LV avec 16 fentes.
Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à des longueurs d’onde de 260 et 280 nanomètres. Diluer la concentration d’ADN à 25 nanogrammes par microlitre avec de l’eau sans nucléase. Créez quatre fois les piscines d’ADN de 200 microlitres en combinant l’ADN de chaque puits dans les quatre blocs de puits 96 dans une plaque de piscine tout en conservant l’identité de la rangée et de la colonne de chaque échantillon.
Ensuite, préparez un tube de mélange principal PCR pour les amorces spécifiques aux gènes en ajoutant dans chaque tampon PCR tube, amorce avant et inverse, et polymése d’ADN selon le manuscrit. Aliquot le maître mélanger dans les puits d’une plaque 96 bien PCR. Ensuite, ajoutez le modèle d’ADN mis en commun.
Chargez les tubes PCR dans un cycleur thermique et utilisez un profil de toucher des roues pour exécuter la réaction PCR sur le cycleur thermique. Pour générer des hétéroduplexes entre les AND dépareillés, incubez les produits PCR dans le cycleur thermique dans un autre programme. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres d’endonuclease cel-1 maison à chacun des produits PCR hétéroduplexés.
Incuber pendant 45 minutes à 45 degrés Celsius. Après cela, mettre fin à la réaction Cel-1 en ajoutant 2,5 microlitres de 0,5 molaire EDTA au pH huit. Chargez 30,5 microlitres de chaque produit traité Cel-1 mélangés à cinq microlitres de teinture sur un gel d’agarose de 3 % et courez à 100 volts pendant deux heures et demie.
Pour déconvoluter les pools mutants, déterminer la zygosité des mutants en exécutant deux réactions PCR pour l’ADN M2 individuel dans lequel la première réaction contient 2,5 microlitres d’ADN M2 et 2,5 microlitres d’ADN de type sauvage et la deuxième réaction ne contient que cinq microlitres d’ADN M2. Ce protocole montre la mutagenisation des petites cultures céréalières et la caractérisation du mutant. La courbe posologique indique des doses optimales de SME pour les taux de survie souhaités de 50 % pour trois espèces différentes de blé.
La présence de phénotypes facilement identifiables dans la population de M2 confirme l’efficacité de la mutagenèse dans les petites populations céréalières. Voici quatre exemples des phénotypes mutants dans les populations de M2 TILLING, d’un mutant albinos dans une population d’orge M2, d’un mutant chlorina dans une population d’orge M2, d’un mutant panaché avec décoloration rose dans une population d’Aegilops tauschii M2, et d’un mutant à faible labour dans une population de Triticum monococcum M2. Une identification mutante à l’aide de Cel-1 sur les plates-formes de gel agarose montre un pool mutant potentiel identifié sur 12 piscines mutantes par des bandes fendées uniques.
La déconvolution des piscines mutantes a déterminé la zygosity de la mutation et a aidé à suivre la mutation vers le bas aux échantillons individuels. La piscine A4 avait des mutations hétérozygotes, indiquées par des bandes fendées dans les échantillons d’ADN de type sauvage box 4 et box 4. La piscine H5 contenait des mutations homozygotes, car des bandes fendées uniques n’étaient présentes que dans l’échantillon d’ADN de type sauvage de type H5 de la boîte 5 H5.
L’étape la plus importante consiste à déterminer la concentration optimale de SME pour atteindre un taux de létalité de 40 à 60 %. Une fois qu’une population tilling avec une fréquence de mutation élevée a été développée, elle peut être utilisée pour la caractérisation fonctionnelle de n’importe quel gène d’intérêt. En outre, la population peut être une source de variation génétique utile pour l’amélioration des cultures.
Tilling a été largement utilisé pour des études génomiques fonctionnelles dans les plantes modèles et cultivées. L’éventail des mutations obtenues peut être missents, knockouts, silent, ou même misspliced formes. Ems est un mutagen.
Par conséquent, utilisez l’équipement de protection individuelle approprié pendant la manipulation du SME. Décontaminer les restes de solutions et les pointes de pipette usés.
