Ce protocole peut aider les scientifiques intéressés par la microscopie non ligneuse à comprendre les composants clés, la mise en place et la procédure d’alignement d’un microscope basé sur la diffusion raman stimulée. Les principaux avantages de la microscopie SRS sont ses capacités à effectuer une imagerie sans étiquette basée sur le contraste vibratoire et à acquérir une image en quelques secondes. La microscopie SRS a conduit l’imagerie sans étiquette à de nouveaux sommets, en particulier les études de structures biologiques complexes telles que les lipides, qui sont fondamentales pour les cellules et l’architecture cellulaire.
Le signal SRS est détecté comme un petit changement dans l’intensité du faisceau de sonde et il peut être corrompu par le bruit. Par conséquent, un signe précis est crucial. Pour commencer, alignez les faisceaux laser OPO et Titanium-saphir afin qu’ils atteignent tous les deux le microscope.
Ensuite, placez les détecteurs du capteur de position du faisceau laser en deux positions entre le miroir dichroïque un et le miroir six. La première position est située près du miroir dichroïque un et la seconde est proche du miroir six. Pour chaque position, utilisez les capteurs pour détecter les coordonnées X et Y du faisceau OPO.
Fait important, vérifiez que les coordonnées X et Y du faisceau laser titane-saphir sont du même OPO dans les deux positions des détecteurs du capteur. Si, dans certaines positions, les coordonnées ne coïncident pas, réglez l’inclinaison du miroir adjacent pour compenser. Suivez cette même procédure pour aligner les positions du faisceau titane-saphir par rapport à l’OPO pour le chemin entre les six et sept du miroir.
Installez un miroir supplémentaire sur une monture flip-flop entre le miroir six et sept et retournez la monture du miroir pour diriger le faisceau dans l’autocorrelateur. Puissance sur le contrôleur autocorrelateur, démarrer l’application logicielle sur l’ordinateur qui le contrôle, et définir la vis de réglage de distance de faisceau de l’autocorrelator à sa position normale à 8,35 millimètres. Ensuite, arrêtez le faisceau titane-saphir et relâchez et projetez le faisceau OPO du miroir supplémentaire au miroir d’entrée de l’autocorrelateur.
Essayez d’ajuster le miroir d’entrée pour maximiser le signal d’impulsion laser comme indiqué ici. Ensuite, arrêtez le faisceau OPO et relâchez et projetez le faisceau titane-saphir du miroir monté sur tong au miroir d’entrée et dans l’autocorrelateur. Répétez le réglage optimal du faisceau jusqu’à ce que le signal autocorrelateur, indiqué ici, soit obtenu.
Maintenant, réglez la vis d’ajustement de distance de faisceau à la position transversale à 7.30 millimètres. Relâchez les deux poutres et numérisez la ligne retardée pour chevaucher les deux poutres. Obtenez le signal trans-corrélateur qui en résulte, comme le montre ici.
Ensuite, retournez le miroir monté sur tongs afin que les poutres puissent atteindre le miroir sept et la tête de balayage du microscope. Retirez le condenseur et utilisez le bouton d’échappement pour retirer temporairement l’objectif subjectif 60x. Faites ensuite pivoter le morceau de nez pour déplacer l’objectif subjectif 60x hors du chemin optique.
Ensuite, montez le détecteur dans la partie supérieure du microscope à l’aide de la monture mécanique externe. Connectez la sortie du détecteur à travers un filtre de passage bas de 50 Ohm à un oscilloscope. Maintenant, allumez le processeur qui contrôle la tête du scanner et projetez le faisceau OPO dans la tête du scanner du microscope.
Surveillez le signal OPO et maximisez la puissance mesurée par le détecteur à l’aide d’un traducteur XY. Ensuite, passez du laser OPO au laser Titanium-saphir et vérifiez qu’un signal est également obtenu pour le laser titane-saphir. Cela indique que les deux poutres sont bien alignées.
Finaliser l’alignement du faisceau en faisant pivoter le morceau de nez pour introduire le subjective 60x. Ensuite, utilisez le bouton de recentrage sur le microscope pour retrouver la mise au point finalisée à la lentille objectif microscope 60x. Enfin, placez l’objectif, avec un grossissement de 40x, à la place du condenseur sans toucher ni déranger l’échantillon.
Réglez la puissance des lasers Titanium-saphir et OPO mesurés avant le microscope à 30 milliwatts pour les deux faisceaux. Ensuite, réglez la longueur d’onde du laser OPO à une valeur différente, par rapport à la précédente, de sorte que la pompe et la sonde ne sont pas en résonance avec la fréquence vibratoire des perles. Ensuite, relâchez les deux faisceaux, de sorte qu’ils entrent dans le microscope.
Exécutez le traducteur informatisé de la ligne de délai de numérisation et enregistrez l’intensité mesurée à l’aide de l’amplificateur de verrouillage pour chaque position de la ligne de retard. Attendez que la numérisation de la ligne de retard soit terminée. Maintenant, réglez la longueur d’onde de l’OPO à 1076 nanomètres, de sorte que la pompe et la sonde sont en résonance avec la fréquence vibratoire des perles.
Exécutez le traducteur informatisé de la ligne de délai de numérisation et attendez que la numérisation de la ligne de retard soit terminée. Enfin, définissez la position obtenue du faisceau de chevauchement et la ligne de retard pour la prochaine acquisition d’images de diffusion Raman stimulées. Pour optimiser la synchronisation spatiale des faisceaux, commencez par arrêter le faisceau titane-saphir et réduisez la puissance de l’OPO à huit milliwatts.
Ensuite, connectez la lecture du détecteur à la carte d’acquisition de données. Exécutez le programme d’acquisition de données avec la console de numérisation au microscope. Une fois terminé, enregistrez le fichier et traiter les données pour obtenir une image comme celle affichée ici.
Ensuite, arrêtez le faisceau OPO et réduisez la puissance titane-saphir à 2,5 à 4,5 milliwatts. Connectez le détecteur avec l’amplificateur de verrouillage et ses réadages avec la carte d’acquisition de données. Ensuite, encore une fois exécuter le programme d’acquisition de données avec la console de numérisation microscope.
Une fois terminé, enregistrez le fichier et traiter les données pour obtenir une image comme celle affichée ici. Introduisez une pile de filtres entre l’objectif 40x et le photodiode pour enlever les impulsions de la pompe et n’acquérir que le signal de charge. Ensuite, réglez le signal de la pompe à 810 nanomètres avec une puissance focalisée de huit milliwatts.
Réglez le signal de la sonde à 1076 nanomètres avec la même puissance focalisée de huit milliwatts pour étudier une liaison carbone-hydrogène typique de polystyrène avec un décalage Raman de 3054 centimètres inverses. Connectez le détecteur à l’amplificateur de verrouillage et à la lecture de l’amplificateur de verrouillage à la carte d’acquisition de données. Enfin, définissez le format pixel et le temps d’acquisition dans le programme microscope et exécutez-le et le système d’acquisition de données, en sauvant le fichier matricielle une fois qu’il est terminé.
Une mesure d’exemple à partir d’un seul point de l’échantillon est affichée ici. Lorsque le faisceau ne se chevauche pas dans le temps ou l’espace, le résultat obtenu est hors résonance, où l’amplitude du signal, mesurée par un amplificateur de verrouillage, est nulle. La phase de ce signal, cependant, saute entre les valeurs négatives et positives.
Si les faisceaux se chevauchent dans l’espace, le signal augmente et atteint son maximum lorsque les faisceaux se chevauchent parfaitement dans le temps, tandis que la phase commence à atteindre une valeur fixe pendant le temps où les faisceaux se chevauchent. Dans une image de transmission, un seul faisceau est utilisé et l’intensité du faisceau transmis à partir de l’échantillon est mesurée par une photodiode. Sur la gauche, l’image de transmission a été obtenue à l’aide d’OPO, tandis qu’à droite, l’image de transmission a été obtenue à l’aide de titane-saphir.
Un exemple typique d’une image SRS est montré ici, dans lequel des images sans étiquette de perles de polystyrène avec des diamètres de trois micromètres sont rapportées. Afin d’obtenir une image de haute qualité, basée sur la microscopie SRS, l’alignement d’un microscope est essentiel. Par conséquent, toutes les étapes indiquées du protocole doivent être effectuées avec soin.
