Ces protocoles que nous avons développés sont importants pour étudier les mécanismes de sécrétion dans les cyanobactéries et leurs produits libérés, à savoir les polymères et les protéines extracellulaires de glucides. Les connaissances générées nous permettront de personnaliser ces produits pour plusieurs applications, à savoir les applications biotechnologiques et biomédicales. Ces protocoles sont très simples.
Ils peuvent être adaptés en fonction de l’organisme producteur, des besoins de l’utilisateur et de l’application finale du produit. Le principal avantage de ces protocoles est qu’ils peuvent facilement être adaptés à d’autres systèmes vivants, en particulier à d’autres bactéries. Ces protocoles sont faciles.
Cependant, on peut avoir besoin d’introduire quelques changements en fonction de la souche bactérienne ou le degré de pureté requis. Pour commencer, cultivez la souche cyanobactérienne dans des conditions standard. Mesurer la croissance à l’aide de protocoles standard.
Ensuite, transférez la culture dans des membranes de dialyse, et dialysez contre un minimum de 10 volumes d’eau déionisée pendant 24 heures avec agitation continue. Centrifuger la culture à 15 000 fois g à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer le supernatant dans un nouveau flacon et jeter la pastille.
Centrifugeuse à nouveau à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour éliminer les contaminants, comme les débris de la paroi cellulaire ou les lipopolysaccharides. Après la centrifugation, transférer le supernatant dans un bécher en verre et jeter la pastille. Pour précipiter le polymère, ajouter deux volumes de 96% d’éthanol au supernatant, et incuber la suspension à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Pour les petites quantités ou non visibles de polymère précipité, centrifugeuse la suspension à 13 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 25 minutes. Jetez doucement le supernatant et resuspendez la pastille en un à deux millilitres d’eau déionisée autoclavée. Transférer la suspension aqueuse sur un flacon.
Pour les grandes quantités visibles de polymère précipité, recueillir le polymère précipité avec des forceps métalliques stériles à un flacon. Presser le polymère et jeter l’excès d’éthanol. Pour effectuer le processus de lyophilisation autrement connu sous le nom de gel-séchage, gardez les flacons avec le polymère précipité à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.
Lyophiliser le polymère pendant au moins 48 heures. Ensuite, conservez le polymère séché dans un dessiccateur à température ambiante jusqu’à nouvel usage. Pour concentrer le milieu, cultivez d’abord des cyanobactéries dans des conditions standard.
Surveiller la croissance de la cyanobactérie à l’aide de procédures standard. Ensuite, centrifugez les cultures à 4000 fois g à température ambiante pendant 10 minutes. Transférer le surnatant dans un flacon et jeter la pastille cellulaire.
Ensuite, filtrez le milieu décanté à travers un filtre de taille pore de 0,2 micron. Pour concentrer le milieu environ 500 fois, utilisez des concentrateurs centrifuges avec un poids moléculaire nominal de trois kilodaltons à centrifugeuse 4000 fois g et 15 degrés Celsius pour un maximum d’une heure par centrifugation ronde. Après centrifugation, rincer les parois du réservoir d’échantillon de l’appareil filtrant avec l’échantillon concentré et transférer le contenu dans un tube de microcentrifugeuse.
Effectuez une étape de lavage supplémentaire du réservoir d’échantillon de dispositif de filtre avec le milieu autoclavé de culture pour assurer la récupération maximale d’exoproteome. Ensuite, conservez les échantillons d’exoprotéome à moins 20 degrés Celsius jusqu’à nouvel usage. L’éthanol doit être ajouté vigoureusement pour optimiser les précipitations et le rendement des polymères.
Après avoir centrifugé le polymère précipité, le rejet du supernatant doit être fait avec soin afin d’éviter la résuspension de la pastille qui peut être lâchement fixée sur le mur de flacon. Si la filtration manuelle est effectuée, il doit être doux pour éviter de casser la membrane du filtre. Certains polymères précipités ne peuvent être visibles qu’après centrifugation, principalement sur les parois des flacons, comme le cas de l’EPS de Synechocystis.
Dans d’autres cas, comme le polymère Cyanothece, il est possible de voir les touffes de polymères flotter dans le bécher de verre juste après les précipitations. Certaines contaminations peuvent être facilement détectées macroscopiquement après la lyophilisation des polymères puisqu’elles modifieront la pigmentation des polymères, généralement blanc ou brun clair. Les polymères oranges sont contaminés par des caroténoïdes ou des structures contenant ces pigments.
Par exemple, les polymères verts sont contaminés par des débris cellulaires et de la chlorophylle. Les exoprotéomes peuvent varier considérablement selon la souche bactérienne. Voir, par exemple, l’exoprotéome d’une cyanobactérie unicellulaire et celui d’une souche filamenteuse.
La quantité élevée de polysaccharides dans les échantillons concentrés d’exoprotéome peut entraver l’analyse de l’exoprotéome. Par exemple, il peut retarder la séparation des protéines et masquer des protéines moins abondantes. L’utilisateur peut caractériser le polymère en termes de composition, de propriétés physiques/chimiques, d’activité biologique des polymères d’essai ou de composants polymères modifiés.
Pour l’identification des protéines, la séparation des protéines dans le gel et la spectrométrie de masse peut être effectuée. Et pour la séparation des vésicules, l’ultracentrifugation de l’exoproteome doit être effectuée. Dans notre groupe, ces protocoles ont déjà ouvert la voie à démêler les mécanismes de sécrétion cyanobactérienne ou les applications des polymères extracellulaires de glucides dans différents domaines, comme dans la biorémédiation ou comme antitumoraux ou agents d’administration de médicaments.
