Notre protocole aide les chercheurs à mettre en œuvre des pipelines expérimentaux normalisés pour effectuer la caractérisation phénotypique de populations similaires par coloration immunofluorescente. Grâce à cette technique, les chercheurs peuvent analyser rigoureusement la composition similaire des tissus complexes de la maladie et effectuer des analyses qualitatives et quantitatives des phénotypes des types de cellules d’intérêt. Sidney Mahan, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour préparer l’animal à la récolte de l’artère brachiocéphale, couper le péritoine jusqu’au sternum, en prenant soin de ne pas endommager les tissus abdominaux. Et faire deux coupures à la ligne axillaire moyenne à travers le thorax, en prenant soin de ne pas endommager le cœur et les poumons. Ensuite, coupez le diaphragme pour exposer partiellement le cœur.
Pour profuser la souris, installez un système de profusion de gravité de telle sorte que la pression du fluide de profusion soit équivalente à la tension artérielle murine moyenne pour permettre une profusion et un entretien cohérents de la morphologie du vaisseau. Puis, profuse l’animal avec cinq millilitres de température ambiante PBS, 10 millilitres de 4%température ambiante paraformaldéhyde, et cinq millilitres supplémentaires de température ambiante PBS. Connectez une aiguille papillon de calibre 23 ou 25 au système de profusion de gravité et courez PBS à travers l’aiguille pour expulser l’air des tubes avant d’insérer l’aiguille dans le ventricule gauche.
Après avoir obtenu l’aiguille en place, utilisez des ciseaux d’iris pour faire une incision de moins de deux centimètres dans l’atrium droit. Récoltez les tissus d’intérêt dans le paraformaldéhyde frais de 4%. Pour exposer l’artère brachiocéphale, utilisez des ciseaux pour faire une incision dans la ligne médiane du sternum à travers le manubrium et utilisez des forceps pour tirer les deux côtés de la cage thoracique pour ouvrir complètement la cavité thoracique.
Ensuite, placez l’animal sous un microscope disséquant pour visualiser partiellement les carotides, et utilisez des pinces fines pour tirer les muscles, le tissu conjonctif et la graisse jusqu’à ce que la carotide droite, l’artère brachiocéphale, la bifurcation subclavienne et l’arc aortique soient nettoyés et isolés du tissu conjonctif et de la graisse environnants. Ensuite, utilisez des forceps pour saisir la carotide droite au-dessous de sa bifurcation et faire une première coupe au-dessus des forceps. Pourtant, tenant la carotide, faire une deuxième coupe à travers l’artère subclavienne et faire les deux dernières coupes à travers l’arc aortique de chaque côté de l’artère brachiocéphale.
Ensuite, recueillir tous les autres tissus vasculaires d’intérêt et de placer l’artère brachiocéphale et les autres tissus dans 4% solution de paraformaldéhyde pendant la nuit à température ambiante. Pour la coloration immunofluorescente de l’artère brachiocéphale, utilisez un microtome pour obtenir 10 sections de micromètres à travers l’échantillon de tissu incorporé paraffine jusqu’à ce qu’il puisse être confirmé par la microscopie légère que l’arc aortique a été sectionné à travers et l’artère brachiocéphale est visible. Ajustez l’orientation du bloc jusqu’à ce que le tissu soit complètement perpendiculaire à la lame de microtome et obtenez trois sections périodiques de 10 micromètres d’épaisseur de l’artère brachiocéphale par glissière de verre, jusqu’à ce que la bifurcation subclavienne soit atteinte.
Lorsque toutes les sections ont été recueillies, hydratez les échantillons de tissus sous une hotte chimique avec deux immersions de xylène de cinq minutes, suivies d’une série d’immersion de cinq minutes à l’éthanol comme indiqué, et de deux immersions d’eau déionisées de cinq minutes. Ensuite, incuber des diapositives dans la solution de récupération des antigènes, selon les protocoles standard, suivies par le chauffage au micro-ondes pendant 20 minutes. Après une heure de refroidissement à température ambiante, utilisez un stylo hydrophobe pour encercler chaque section tissulaire.
Et bloquez toute liaison non spécifique avec tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, étiquetez les échantillons de tissus pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec le cocktail principal d’anticorps d’intérêt, ou isotype assorti aux anticorps de contrôle IgG. Le lendemain matin, le lavage glisse trois fois en PBS pendant cinq minutes par lavage, suivi d’une incubation d’une heure dans le cocktail d’anticorps secondaire conjugué fluorescence approprié et DAPI pour la visualisation du noyau.
Ensuite, utilisez un support de montage adapté à la microscopie de fluorescence pour monter des coverslips sur les toboggans. Pour l’imagerie par microscopie confocale des sections de tissus étiquetés, utilisez des sections tachées du contrôle IgG et des anticorps primaires pour définir la sensibilité du détecteur, sa puissance laser et sa compensation pour chaque canal individuel. Ensuite, définissez les positions supérieures et inférieures pour l’acquisition de z-stack et déterminez l’épaisseur et le nombre de piles à imager.
Lorsque toutes les images ont été acquises, ouvrez les images d’ImageJ et ouvrez le panneau d’outils de canal et pseudo colorez les différents canaux de coloration. Fusionner les canaux de couleur. Tous les canaux doivent être visibles sur la même image.
Activez et éteignez les canaux de couleur individuels dans le panneau d’outils du canal, et cliquez à droite sur l’icône de comptage pour sélectionner l’outil multi-points. Double clic sur l’icône de comptage pour ouvrir le panneau d’outils point et sélectionner le type et la taille des éléments utilisés pour compter les cellules. Vérifiez tout afficher et activez le canal DAPI uniquement dans le panneau d’outils du canal.
Ensuite, sélectionnez le canal compteur zéro et cliquez sur les noyaux individuels à tagués, en faisant défiler les z-stacks pour compter tous les noyaux tachés dans la région d’intérêt. Le nombre d’événements quantifiés à cellule unique sera indiqué ci-dessous dans le panneau d’outils à points. Lorsque tous les noyaux ont été marqués, allumez un autre canal de coloration et sélectionnez le canal de compteur un pour marquer les cellules dans lesquelles il y a une colocalisation entre le DAPI et la coloration des anticorps.
Pour la coloration cytoplasmique, sélectionnez les cellules avec coloration entourant le noyau dans toute la profondeur du noyau, en vérifiant plusieurs z-stacks si nécessaire. Les résultats peuvent ensuite être exprimés comme le nombre de cellules au nombre total de cellules positives DAPI, ou le nombre de cellules par zone dans la région d’intérêt. La coloration immunofluorescente avec des anticorps ciblant les marqueurs phénotypiques, comme démontré, permet d’acquérir des images de chaque marqueur individuel de coloration et de contraste différentiel d’interférence pour la délimitation des régions d’intérêt pour le comptage d’une seule cellule.
Le comptage d’une seule cellule pour déterminer l’abondance de différentes populations lisses dérivées de cellules musculaires peut ensuite être effectué à l’aide d’ImageJ. Par exemple, l’analyse de comptage de cellules simples dans la région fibreuse de chapeau de ces sections transversales représentatives a indiqué des différences remarquables dans la composition cellulaire de la zone fibreuse de chapeau entre les souris traitées avec l’anticorps bêta d’IL-1 et les souris traitées avec un contrôle IgG assorti d’isotype. En effet, l’inhibition de la bêta il-1 a été associée à une diminution des cellules musculaires lisses YFP-positives, et à une augmentation des cellules galectin-3-positives.
En outre, une diminution du nombre de YFP-positif muscle lisse alpha actin-positif cellules musculaires lisses a été observée. Tandis que le nombre relatif de macrophages yfp-positifs de galectin-3-positifs lisses de cellules de muscle a été sensiblement augmenté aux deux emplacements brachiocephalic d’artère. Notamment, l’inhibition de la bêta IL-1 n’a pas eu d’impact sur le nombre global de cellules ostéochondrogènes dans la lésion, ni sur la proportion de cellules chondrogenic lisses dérivées des cellules musculaires ou dérivées du macrophage.
Ce protocole a été conçu pour améliorer la rigueur et la reproductibilité dans l’analyse des lésions athéroclérotiques en standardisant les étapes clés telles que la collecte, le traitement et la sectionnement des tissus, ainsi que le comptage des cellules simples. Ce protocole peut être employé pour analyser les lits vasculaires additionnels enclins à présenter des lésions athérosclérostiques comprenant l’aorte et la racine aortique.
