Ce protocole décrit la méthode de caractérisation moléculaire complète et impartiale d’un seul échantillon en utilisant à la fois la spectrométrie de masse, en utilisant la métabolomique, la protéomique et la lipidomique, et les plates-formes nucléaires de spectroscopie par résonance magnétique. L’importance de cette approche est que nous pouvons caractériser un système biologique en aval du génome, en identifiant différents types de molécules, ce qui nous permet d’déduire les voies métaboliques et de décomposition. Technique d’extraction séquentielle, permettre l’extraction de composés polaires biodisponibles à l’aide de l’eau, suivie de MPLEx pour capturer d’autres composés polaires ou métabolites ainsi que des protéines et des lipides à partir d’un seul échantillon.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle parce qu’elle guide le scientifique en séparant les trois couches au cours de la deuxième étape d’extraction, et en divisant les extraits entre différents instruments d’analyse. Les analyses multi-omiques intégratives permettent des investigations plus efficaces et une compréhension complète des systèmes biologiques complexes. Cette méthode robuste extrait une grande diversité de molécules et s’applique à divers types d’échantillons.
Commencez cette procédure par la collecte et la préparation des échantillons tels que décrits dans le protocole texte. À l’aide d’un ustensile en acier inoxydable lavé à l’éthanol, aliquot 50 milligrammes de chacun des échantillons séchés en tubes de verre individuels de deux millilitres. Ajouter un millilitre d’eau distillée et dégazée à chaque échantillon.
Ensuite, capuchon les flacons et secouer pendant deux heures sur une table shaker. Centrifuger les échantillons à 15 mille fois la gravité pendant 30 minutes. Et ensuite permettre aux solutions de se tenir à température ambiante pendant 20 minutes.
Décanter et enregistrer le surnatant de chaque échantillon. Effectuer une extraction MPLEx sur les résidus maintenant extraits d’eau en répétant ces étapes d’extraction. Sauf pour substituer un moins 20 degrés Celsius quatre à trois chloroformes au mélange de méthanol pour l’eau distillée et dégazée.
Séparez soigneusement les deux couches de solvants qui en résultent, qui seront visuellement discernables en enlevant la couche supérieure par un tuyautage minutieux. Séchez la couche inférieure non polaire dans le séchoir à congélation. Dès qu’il est sec, ajouter cinq microlitres de chloroforme et 195 microlitres de méthanol s’ils sont analysés dans les prochains jours.
Pour améliorer l’efficacité d’ionisation d’électrospray pour la spectrométrie de masse de résonance de cyclotron d’ion de fourier-transformer, abrégé FTICR-MS par injection directe. Diluer l’extrait de chloroforme un à un dans le méthanol, et l’extrait d’eau deux à un dans le méthanol. Calibrer le spectromètre FTICR en injectant directement 100 microlitres d’une solution de réglage, couvrant une plage de masse d’environ 100 à 1 300 daltoniens, dans le FTICR-MS.
Injecter directement 100 microlitres de la norme d’acide fulvic de la rivière Suwannee à la source d’ionisation de l’électrospray. Couplé au spectromètre FTICR à l’aide d’une pompe à seringues réglée à un débit de 3,0 microlitres par minute. Réglez la tension de l’aiguille à 4,4 kilovolts positifs.
File d’attente un à 100 masse à charge ratio et le verre capillaire à 180 degrés Celsius. Inspectez les spectres qui en résultent à l’aide du logiciel d’analyse pour confirmer la qualité des données. Maintenant, introduisez 100 microlitres de chaque extrait par injection directe à la source d’ionisation d’électrospray, couplé au spectromètre de FTICR par une pompe de seringue réglée à un taux d’écoulement de 3.0 microlitres par minute.
Définissez les paramètres comme avant. Ajuster le temps d’accumulation d’ion pour chaque échantillon ou groupe d’échantillons pour tenir compte de la variation de la concentration de carbone. Recueillir 144 scans pour chaque échantillon, faire la moyenne des analyses, puis effectuer un étalonnage interne à l’aide d’une série homologue CH2.
Séchez les extraits à l’aide d’un concentrateur et enregistrez le reste des extraits pour la spectrométrie de masse de chromatographie gazeuse ultérieure, la spectrométrie de masse chromatographie liquide et l’analyse de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire. Pour se préparer au GC-MS, préparez d’abord des échantillons de contrôle vierge tels que détaillés dans le protocole texte. Pour protéger les groupes de carbinols ajouter 20 microlitres de 30 milligrammes par millilitre hydrochoxamine hydrochlorure à Paradyne à chacun des échantillons, y compris les extraits de méthanol, les extraits d’eau, les blancs et les échantillons d’étalonnage FAME.
Sceller les flacons avec des bouchons. Vortex les extraits pendant 20 secondes, puis sonifier les extraits pendant 60 secondes. Centrifugeuse les extraits à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes à 100 fois la gravité.
Ajouter 80 microlitres de MSTFA avec 1% trimethylchlorosilane à chaque échantillon. Après le vortex et la sonification des extraits comme avant, centrifuger les extraits à nouveau à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 fois la gravité. Après refroidissement des extraits à température ambiante, transférer dans des flacons autosampler GC-MS.
Procédez à l’analyse GC-MS et au traitement des données tel que décrit dans le protocole texte. Pour se préparer à l’analyse nmr à l’état liquide, diluer le reste des extraits d’eau de 10% avec une norme interne DSS de cinq millimolaires. Transférer le mélange dans un tube NMR en verre borosilicate de diamètre extérieur de haute qualité de trois millimètres.
Procédez à l’analyse NMR et au traitement des données tel que décrit dans le protocole texte. Pour effectuer l’analyse lipidomique LC-MS, injectez 10 microlitres de chaque extrait dans un système de chromatographie liquide ultra performant, couplé à un spectromètre de masse Orbitrap à l’aide d’une colonne hybride de surface chargée en phase inversée. Définissez un gradient de 34 minutes tel qu’indiqué dans le protocole texte à un débit de 250 microlitres par minute.
Utilisez des modes d’ionisation négatifs et positifs avec une dissociation plus élevée des collisions d’énergie et une dissociation induite par la collision. Pour effectuer l’analyse protéomique, extraire d’abord des protéines selon le protocole MPLEx pour le reste de la phase de méthanol tel que décrit dans le protocole de texte. La tourbe a été comparée à la profondeur de la tourbière S1 à la réponse de l’épinette et des tourbières dans des environnements changeants ou sur le site de l’ÉPINETTE au Minnesota, aux États-Unis.
3 312 enzymes ont été identifiées dans l’analyse protéomique. Une analyse des activités enzymatiques avec profondeur révèle que le nombre d’enzymes diminue fortement entre 15 centimètres et 45 centimètres dans la tourbière spruce. Pour montrer comment les sites peuvent varier dans les activités métabolites et enzymatiques, les résultats de l’ÉPINETTE sont comparés à ceux d’une tourbière de pergélisol et de fen dans le nord de la Suède.
Dans l’ensemble, 67 040 métabolites ont été identifiés dans tous les échantillons de tourbe du SPRUCE provenant de la combinaison des analyses FTICR-MS, NMR, GC-MS et LC-MS. Il est indiqué ici la fraction relative des différentes classes chimiques identifiées par diverses techniques dans les différentes profondeurs. Bien que les acides aminés et les sucres diminuent avec la profondeur, ce n’est pas observé pour les lipides.
En validant croiséement les métabolites identifiés dans toutes les analyses par rapport à la base de données KEGG, il a été déterminé que les composés identifiés sont impliqués dans des voies métaboliques communes telles que le cycle de l’acide tricarboxylique, la glycolyse et le métabolisme du sucre. Tout au long de cette procédure, il est essentiel d’être conscient des sources potentielles de contamination. À partir de la collecte de l’échantillon par l’analyse, les échantillons ne devraient pas entrer en contact avec des plastiques fixés qui peuvent nuire à l’ionisation.
Bon nombre des solvants utilisés pendant la procédure d’extraction sont dangereux ou inflammables. Portez toujours des EPI appropriés pour éviter tout contact avec la peau et les yeux, ainsi que pour éviter de contaminer les échantillons.
