L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthode pour évaluer l’activité endogène de kinase LRRK2 dans le sang périphérique humain. Ceci est réalisé en surveillant la phosphorylation lrrk2-médiée des protéines de Rab, employant les anticorps monoclonaux de Rab phospho-spécifiques de fondation de Michael J.Fox. Ici, nous nous concentrons sur les neutrophiles sanguins périphériques humains comme constituant de la population homogène de site avec des niveaux élevés d’expression de Rab2 et rab10.
L’isolement du neutrophile est basé sur une sélection négative qui, dans les 40 minutes de l’action terminée permet l’isolement de 99% des neutrophiles purs et viables tout en donnant une grande quantité de niveaux de protéines. Recueillir 10 millilitres de sang dans un tube de collecte de sang. Mélanger délicatement en inversant les tubes sept à huit fois.
Transférer 10 millilitres de sang dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter au sang 100 microlitres de solution de stock EDTA 1, 0,1 molar EDTA PBS Solution, mélanger délicatement. Ajouter 500 microlitres cocktail d’isolement, 50 microlitres par millilitre de la trousse d’isolement neutrophile à l’échantillon de sang entier.
Vortex les perles magnétiques du kit d’isolation neutrophile pendant 30 secondes avant utilisation afin de résuspendre les perles magnétiques très fines. Ajouter 500 perles magnétiques de microlitres à l’échantillon de sang et mélanger délicatement en inversant le tube plusieurs fois. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Rechargez le tube jusqu’à 50 millilitres avec la solution de stock EDTA 2. Il s’agit d’une solution millimolaire EDTA PBS. Mélanger en descendant très doucement de haut en bas deux à trois fois.
Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter l’agitation ultérieure du tube. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Suspension cellulaire enrichie de pipette soigneusement qui contient des neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.
Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant et évitez la collecte et la perturbation des globules rouges au fond du tube. Laissez environ 10 millilitres de la suspension des globules rouges derrière au fond du tube. Vortex perles magnétiques pendant 30 secondes avant utilisation et ajouter 0,5 millilitre perles magnétiques au tube contenant les neutrophiles enrichis.
Mélanger délicatement en inversant le tube. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter toute agitation ultérieure.
Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Pipette soigneusement la suspension cellulaire enrichie qui contient des neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant.
Laisser environ cinq millilitres de suspension au fond du tube. Pour assurer l’élimination complète des perles magnétiques du mélange cellulaire, placez le tube contenant des cellules enrichies dans l’aimant. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
Pipette soigneusement la suspension cellulaire enrichie qui contient maintenant des neutrophiles purs dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant. Laissez environ cinq millilitres de suspension au fond du tube.
Recharger les cellules isolées avec une solution millimolaire de stock EDTA 2 à un volume final d’environ 41 millilitres. Pipette de haut en bas pour mélanger. Divisez également la solution en deux tubes d’environ 20 millilitres dans chaque tube.
Centrifugeuse des deux tubes à 335G pendant cinq minutes. Pendant l’étape de centrifugation, prendre le stock inhibiteur de MLi-2, 200 micromolaire slash 1000X concentration du congélateur moins 80 degrés et laisser à température ambiante pour une utilisation ultérieure. Immédiatement après l’étape de centrifugation et sans agitation des tubes, versez le supernatant sans déranger les granulés de neutrophile.
resuspendez chaque granule cellulaire en 10 millilitres de milieu de culture cellulaire à température ambiante en pipetting doucement les cellules de haut en bas quatre fois. Étiquetez un tube DMSO et l’autre tube MLi-2. Au tube étiqueté DMSO ajouter 10 microlitres de DMSO et ajouter 10 microlitres de 200 micromolaires MLi-2 solution de stock en pipetting doucement de haut en bas pour mélanger.
Incuber des échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Mélanger délicatement par inversion toutes les 10 minutes pendant la période d’incubation. Pendant le traitement inhibiteur de la kinase LRRK2 de 30 minutes, retirez la solution de stock DIFP molaire du congélateur à moins 80 degrés et placez-la dans le capot de fumée sur la glace.
Ensuite, déplacez un milligramme par millilitre solution de stock microcystine-LR à partir du congélateur de moins 80 degrés et placez-le à température ambiante pour décongeler. Décongeler un aliquot, 0,25 millilitre du tampon de lyse en le sortant du congélateur, permettre de décongeler à température ambiante, puis le placer sur la glace pour une utilisation ultérieure. Préparez un millilitre de milieu RPMI contenant un microlitre de DMSO appelez ce tampon de resuspension DMSO.
Préparez un millilitre de milieu RPMI contenant un microlitre de 200 micromolaire MLi-2 ou un inhibiteur alternatif de kinase LRRK2 et appelez ce tampon de resuspension MLi-2. Après la période d’incubation de 30 minutes, centrifuger les deux tubes à 335G pendant cinq minutes, comme avant. Jetez soigneusement le supernatant dans chaque tube sans déranger la pastille de neutrophile.
Pour le tube étiqueté DMSO, résuspendez doucement les granulés dans un millilitre de tampon de resuspension DMSO. Et pour le tube étiqueté MLi-2, réutilisez les granulés dans un millilitre de tampon de resuspension MLi-2. Transférer les granulés cellulaires résuspendus vers les tubes de centrifugation correspondants étiquetés DMSO et MLi-2 et les centrifugeuses des deux tubes à 335G pendant trois minutes.
Pendant l’étape de centrifugation, préparer le tampon de lyse. Dans le capot des vapeurs, ajouter soigneusement 0,25 microlitres de solution DIFP molaire de 0,5 molaire, ainsi que 0,25 microlitres d’un milligramme par millilitre microcystine-LR au tampon de lyse de 0,25 millilitre. Mélanger et laisser sur la glace jusqu’à utilisation.
Immédiatement après la centrifugation, retirer soigneusement et complètement tout supernatant à l’intérieur d’une pipette sans déranger la pastille de neutrophile et placer les tubes sur la glace. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de tampon de lyse contenant du DIFP et de la microcystine-LR à chaque tube. À l’aide d’une pipette de 100 à 200 microlitres, résuspendez les granulés cellulaires en faisant monter et descendre environ cinq à dix fois.
Allongez les cellules sur la glace pendant 10 minutes. Puis, des tubes de centrifugeuse à 20 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour enlever les débris cellulaires. Transférer le supernatant DMSO et MLi-2 contenant des lysates de neutrophile dans de nouveaux tubes de centrifugation.
Jeter les granulés de débris. Les lysates de neutrophile sont maintenant prêts à l’emploi ou peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à moins 80 degrés pour une analyse future. À l’aide des données de la base de données d’importation accessible au public, ce graphique montre qu’une abondance des protéines LRRK2 et Rab10 est particulièrement élevée dans les neutrophiles et les monocytes sanguins périphériques humains.
Isoler les neutrophiles sanguins périphériques humains avec cette procédure entraîne un rendement impur élevé des cellules. Le tableau en haut montre le nombre total de cellules isolées de 10 millilitres de sang périphérique provenant de trois donneurs en bonne santé. La pureté et la viabilité des cellules isolées ainsi que le rendement total en protéines lysate sont également démontrés.
Après traitement avec et sans l’inhibiteur de kinase LRRK2, MLi-2, les neutrophiles sont lysés en présence de l’inhibiteur puissant de protéase, DIFP. Pour la figure B sur le côté gauche, 10 microgrammes d’extraits de cellules entières par voie ont été soumis à l’analyse quantitative multiplexe d’immunoblot avec les anticorps indiqués. Le chiffre de droite, C, démontre l’importance du DIFP pour la prévention de la dégradation protéolytique, en particulier de la grande protéine LRRK2.
En comparaison, les concentrations élevées de PMSF seules sont moins efficaces. Voici montré que la phosphorylation rab10 contrôlée par LRRK2 est significativement augmentée d’environ trois fois dans les neutrophiles périphériques de sang dérivés des patients présentant la maladie héréditaire de Parkinson hébergeant une mutation hétérozygote de VPS35 D620N par rapport aux contrôles. Le graphique supérieur montre l’analyse des immunoblots multiplexes et le fond, dont la quantification est.
Ceci suggère que la mutation VPS35 D620N active le chemin de kinase de LRRK2 de l’activité par un mécanisme pourtant inconnu. En résumé, nous présentons un essai facile et robuste pour mesurer l’activité de voie de kinase de LRRK2 en surveillant la phosphorylation de protéine de Rab, telle que Rab10, dans les neutrophiles périphériques-dérivés humains, cette méthode nous permet d’évaluer l’activité de voie de LRRK2 et de déterminer comment les mutations, les états de la maladie ou les inhibiteurs modulent l’activité de voie de LRRK2.
