Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés, sur le développement de biofilms, tels que la façon d’identifier les conditions environnementales clés, qui affectent la croissance des biofilms et les caractéristiques comportementales pendant le développement. Le principal avantage de cette technique, c’est que les plaques micro-fluidiques multicanaux permettent l’acquisition rapide de résultats statistiquement significatifs. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la structure du biofilm, elle peut également être appliquée à l’étude des traitements antibiotiques et à la biorémédiation.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal, parce qu’une attention particulière aux détails du protocole et des compétences méticuleuses, sont nécessaires. Pour éviter une erreur de connexion de l’instrument au logiciel, allumez d’abord le poste de travail pc, suivi du module de fluorescence. Assurez-vous que l’obturateur de fluorescence est en mouvement et allumez les contrôleurs matériels.
Ensuite, allumez le contrôleur du système d’imagerie et la caméra CCD. Ensuite, allumez la station d’imagerie. Lorsque tout l’équipement est prêt, démarrez l’application de commande et entrez le numéro de plaque, situé sur l’étiquette sur le côté de la plaque.
Pour l’amorçage, retirez d’abord la plaque micro-fluidique de 48 puits de l’emballage, sans toucher la surface vitrée au fond de la plaque, et nettoyez la glissière de verre au fond de la plaque, à l’aide d’un tissu de lentille. Pour amorcer les canaux micro-fluidiques, pipette 200 microlitres de 37 degrés Celsius milieu minimal dans le puits de sortie, en prenant soin d’éviter les bulles. Ensuite, placez la plaque sur la scène de la plaque.
Essuyez l’interface avec l’éthanol, en l’scellant sur le stade de la plaque une fois que l’éthanol a séché. En mode manuel sur le module de commande, réglez le fluide comme bouillon Luria-Bertani à 37 degrés Celsius, et max sheer comme cinq dym par centimètre carré. Cliquez sur les puits de sortie pour activer le flux de la sortie vers le puits d’entrée, pour amorce les canaux.
Après cinq minutes, mettre en pause l’écoulement pour se préparer à l’ensemencement et retirer soigneusement la plaque de la scène. Ensuite, aspirez tout milieu résiduel de la sortie bien sans enlever aucun milieu du cercle intérieur qui conduit aux canaux micro-fluidiques. Pour ensemencer les canaux expérimentaux, ajouter 300 microlitres de milieu minimal dans le puits d’entrée, suivi de l’ajout de 300 microlitres de culture bactérienne, dans le puits de sortie.
Retournez la plaque à l’étape de l’imagerie en vous assurant d’essuyer l’interface avec de l’éthanol avant de la placer sur la plaque, et utilisez le flux de la caméra en direct pour vous concentrer sur un seul canal. Tout en surveillant visuellement l’alimentation en direct, reprendre le flux à 1 à 2 dym par centimètre carré pendant environ 2 à 4 secondes, Pour permettre aux cellules d’entrer dans le canal expérimental, mais pas les canaux serpentins, et laisser la plaque sur le stade de température contrôlée pendant une heure, pour permettre aux cellules de s’attacher. À la fin de la période d’attachement, retirez soigneusement la plaque du stade et aspirez bien les bactéries de la sortie sans perturber le canal.
Ensuite, utilisez une nouvelle pointe pipette pour retirer le milieu des puits d’entrée. Dans le logiciel, ouvrez l’acquisition dimensionnelle multiple pour contrôler l’acquisition d’image de microscope, et sélectionnez le laps de temps, les positions multiples d’étape, et les longueurs d’onde multiples. Dans l’onglet enregistrement, créez un nom de base simple, en vous assurant que le nom de base des empiétements s’il existe un fichier est vérifié.
Inclure tous les détails essentiels de l’expérience dans la description. Cliquez sur sélectionnez répertoire, pour sélectionner le dossier dans lequel tous les fichiers seront enregistrés Sous l’onglet time lapse, ajuster la durée du temps expérimental, à 24 heures, et définir l’intervalle de temps pour acquérir des images toutes les cinq minutes tout au long de l’expérience. Utilisez le flux de caméra en direct et l’objectif 10x pour définir les positions de scène, en se concentrant sur le centre du canal, situé au-dessus ou en dessous des numéros de canal gravés sur la plaque.
Passez à l’objectif 20x et localisez la zone de visualisation optimale et le plan focal à l’intérieur du chenal. Ensuite, ajoutez la position de la scène à la liste avec les nouveaux paramètres. Sous le menu longueurs d’onde, réglez le nombre de longueurs d’onde à 3, et réglez la première longueur d’onde à fitc 100% caméra, avec un temps d’exposition de dix millisecondes, la deuxième longueur d’onde à brightfield 50% caméra 50% visible, avec un temps d’exposition minimal de 3 millisecondes et la troisième longueur d’onde à tous fermés, de sorte qu’aucune lumière reste sur le dernier canal entre les temps d’acquisition.
Dans le menu Modifier AutoRun, ouvrez l’onglet configuration du protocole et définissez un nouveau protocole d’une durée de 24 heures avec le flux défini dans la direction avant au taux de cisaillement expérimental approprié. Cliquez sur ajouter et enregistrer pour enregistrer le protocole et ouvrir l’onglet configuration de séquence. Pour configurer une nouvelle séquence, sélectionnez le bouillon Luria-Bertani à 37 degrés, comme fluide par défaut pour tous les canaux.
Sous l’étape itération 1 pour les canaux 1 à 12, sélectionnez le protocole avec le premier taux de cisaillement expérimental et activer tous les canaux. Pour les canaux 13 à 24, sélectionnez le protocole avec le deuxième taux de cisaillement expérimental et activez tous les canaux. Sélectionnez Ensuite Appliquer et enregistrer as, pour enregistrer la séquence et ouvrir le menu AutoRun pour sélectionner la séquence enregistrée à utiliser pour l’AutoRun.
Pour mettre en place l’expérience de biofilm à croissance infimes, ajouter jusqu’à 1300 microlitres de milieu minimal stérile dans le puits d’entrée de la plaque micro-fluidique, et remettre la plaque au stade d’imagerie. Ensuite, essuyez l’interface avec de l’éthanol et scellez la plaque. Confirmez que les protocoles et les séquences sont correctement mis en place.
Sélectionnez démarrer, pour démarrer l’AutoRun, et cliquez immédiatement sur acquérir pour démarrer la collection d’images microscope. À la fin de la première acquisition d’image, cliquez sur pause et sélectionnez le mode image en direct dans la longueur d’onde brightfield. Sélectionnez aller pour afficher chaque position de scène, et sélectionnez défini à jour, pour définir les nouveaux paramètres.
Ensuite, cliquez sur reprendre, avant de commencer la prochaine acquisition prévue. Dans cette expérience représentative de croissance du biofilm à temps, la couverture du biofilm, ou zone de surface seuil en pourcentage, était différente pour les trois paramètres de cisaillement, ce qui indique que le cisaillement a eu une influence directe sur la couverture de surface du biofilm. La mesure relative totale de l’accumulation de biofilms a augmenté en fonction du temps, le taux de croissance étant passé du stress de cisaillement le plus élevé au stress de cisaillement le plus bas.
Sous chaque condition, il y avait aussi une période claire de croissance exponentielle à partir de laquelle un taux de croissance quantitatif pouvait être calculé. Dans l’ensemble, le coefficient de rugosité a diminué au fil du temps dans toutes les conditions de cisaillement, ce qui indique que toutes les surfaces du biofilm sont devenues plus lisses. Cependant, par rapport au cisaillement le plus bas, les réglages de cisaillement plus élevés ont donné lieu à une surface plus lisse au fil du temps, ce qui indique qu’un flux de cisaillement plus rapide contribue à une surface plus lisse et plus propre.
En outre, l’entropie texturale, ou le caractère aléatoire dans la morphologie, a augmenté au fil du temps pour toutes les conditions de cisaillement. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre la séquence spécifiée et de prendre le temps d’effectuer chaque étape avec précision. Les compétences nécessaires peuvent prendre quelques courses à maîtriser.
Après cette procédure, d’autres méthodes telles que HBLC ou GCMS, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les concentrations de sous-straights, tels que le glucose, consommés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine des biofilms pour explorer les environnements de flux généraux en temps réel avec des conditions expérimentales contrôlées et l’échantillonnage par hydrothérapie. N’oubliez pas que travailler avec des souches bactériennes BSL2 peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d’équipement de protection approprié et l’utilisation de protocoles de déchets appropriés doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
