L’évaluation mini-endoscopique du côlon chez les souris vivantes fournit le soutien expérimental clé pour étudier des manifestations intestinales de la maladie graph-versus-hôte aiguë, GvHD, sur la transplantation allogénique et hématopoïétique de cellules souches. L’évaluation non invasive de la colite aiguë liée au GvHD peut fonctionner comme un substitut de travail à l’histopathologie d’étalon-or, rendant ainsi inutiles les sacrifices répétés d’animaux pour obtenir des spécimens de tissus. Vera Buchele, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Un jour après l’irradiation du corps total des souris BALB/c receveurs, placez un CD-45.1 vivant 5B6 souris donneur SJL en position couchée sur une gaine de travail propre, et utilisez une pointe courbée et dentelé de 13 cm d’un forceps simkin pour soulever la fourrure à son talon d’Achille. À l’aide de ciseaux fins durcis de 8,5 cm avec des pointes droites, incisez la peau entre les forceps et un talon, allongeant l’incision cranially pour faciliter l’enlèvement de la peau et de la fourrure des membres postérieurs. Lorsque la peau a été enlevée des membres postérieurs, coupez chaque articulation de la hanche, de la cheville et du genou.
Conservez la cuisse et la tige de chaque membre postérieur dans une seule boîte de Pétri de 92 mm remplie de PVS sur glace et retirez soigneusement autant de muscle que possible de chaque os, en transférant chaque fémur et tibia nettoyés dans un tube de 50 mL de RPMI stérile 1640 milieu sur glace mouillée. Pour isoler la moelle osseuse, transférez un os à la fois dans une nouvelle boîte de Pétri de 92 mL remplie d’un milieu RPMI 1640 frais, et utilisez un scalpel pour couper les extrémités de chaque os. Ensuite, utilisez une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille de calibre 26 pour rincer les os avec 1 mL de milieu frais à la fois dans un tube de collecte de 50 mL contenant 5 mL de milieu.
Lorsque tous les os ont été rincés, pipette doucement les morceaux de moelle osseuse friable de haut en bas à plusieurs reprises pour générer une suspension à cellule unique avant de filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire à mailles de 40 micromètres dans un nouveau tube de collecte de 50 mL. Pelleter les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau les cellules dans 5 mL de tampon de lyse de potassium chlorure d’ammonium pour une incubation de trois minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction avec 10 mL de PVS, et centrifuger les cellules à nouveau.
Re-suspendre la pastille dans 2 mL de PVS frais pour le comptage, et mettre de côté un six fois 10 à la sixième cellule aliquot pour l’analyse cytométrique flux en aval. Ensuite, utilisez un kit de purification cellulaire disponible dans le commerce pour épuiser magnétiquement les lymphocytes T CD90.2 positifs de la suspension à cellule unique de la moelle osseuse, selon les instructions du fabricant, et mettez de côté une fois 10 à la sixième cellule aliquot de l’évauate épuisé par cellule T pour l’analyse cytométrique du flux en aval de la pureté et de la composition cellulaires avant et après la séparation. Ensuite, utilisez une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de calibre 30 pour injecter cinq fois 10 à la cinquième cellule T de moelle osseuse appauvrie en 100 microlitres de PVS par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbar du sinus veineux de chaque animal receveur irradié.
Le lendemain, placez une rate récoltée chez un animal donneur sur une passoire en maille de 40 micromètres dans un tube de collecte de 50 mL, et utilisez un piston à seringues pour presser le tissu de la rate à travers la passoire dans le tube. Lavez la passoire et le piston avec pvs pour recueillir tous les splenocytes, et pelleter les cellules par centrifugation. Après la lyse rouge de globules rouges est démontrée, re-suspendre les globules blancs pour compter, et mettre de côté un six fois 10 à la sixième cellule aliquot pour l’analyse cytométrique de flux en aval.
Pour un isolement total des lymphocytes T CD3 positifs par rapport au total des splenocytes, utilisez un kit de purification cellulaire disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant, et réservez un aliquot à cellule T un fois 10 à la sixième lymphocyte T CD3 positif de la fraction de cellule positive pour l’analyse cytométrique du flux en aval de la pureté et de la composition cellulaires avant et après la séparation. Ensuite, injectez sept fois 10 à la cinquième cellule T CD3-positive alloreactive dans 100 microlitres de PVS par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbar de chaque souris destinataire pour induire GvHD. Pour marquer les lésions liées à la GvHD par mini-endoscopie de la région colorectale distale, soulevez la queue d’un animal receveur juste au-dessus de la racine de la queue d’une main, et utilisez l’autre main pour insérer soigneusement l’endoscope dans le rectum par l’intermédiaire de l’anus.
Tandis que le flux d’air gonfle le lumen côlorectal, déplacez lentement et soigneusement l’endoscope vers l’avant dans la direction aboral. Pour éviter les blessures de l’intestin du côlon, gardez l’endoscope dans la zone centrale du lumen en utilisant l’écran vidéo en direct pour aider à ce positionnement. Commencez à enregistrer le flux vidéo et marquer l’inflammation, en évaluant l’inflammation liée à GvHD du côlon en marquant les paramètres comme illustré.
Lorsqu’un point de notation a été localisé, déplacez l’endoscope doucement et légèrement d’avant en arrière pour évaluer les différents paramètres. Pour évaluer la translucidité des paramètres et la consistance des selles, placez l’endoscope à une distance plus large par rapport à la paroi du côlon. Pour évaluer la granularité et la vascularité de la lésion, placez l’endoscope à proximité de la paroi du côlon, et appliquez soigneusement une tension bien dosée à la paroi du côlon avec la pointe de l’endoscope.
À la fin du processus de notation, arrêtez l’enregistrement. Comparé aux contrôles, la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïiques telle que démontrée produit une induction reproductiblement robuste d’un phénotype systémique de GvHD, avec des scores cliniques progressivement croissants de GvHD chez les animaux destinataires. Ces critères mini-endoscopiquement évaluables ont été spécifiquement adaptés de la colite syngénéique précédemment rapportée dans le contexte des paramètres de notation de colite allo-réponse-conduits pour la description précise, la notation, et le classement des lésions intestinales GvHD-maladie-associées dans le côlon distal.
En effet, le système de classement mini-endoscopique permet une discrimination facile des souris recevant des lymphocytes donneurs avec des signes graves d’inflammation intestinale de souris témoins qui sont essentiellement dépourvues de GvHD. Invalidation du système de classement à base mini-endoscopique études histopathologiques a confirmé que le côlon des souris gravement affectées par l’inflammation liée à la GvHD affichent des signes histopathologiques similaires forte de l’inflammation. En revanche, les tissus du côlon des souris témoins ont montré non, tout au plus, aux signes histopathologiques doux de l’inflammation, en accord avec l’absence virtuelle des signes mini-endoscopiquement détectables de colite.
En outre, les études de corrélation entre mini-endoscopically et histopathologically évalué l’activité de colite et les scores systémiques de GvHD démontrent que mini-endoscopically déterminé quelques scores de moins ou égal à trois prévoir de manière fiable l’absence des scores intestinaux mi-à plus élevés d’inflammation du côlon GvHD-associés obtenus du classement histopathologique. En outre, la sévérité du GvHD intestinal endoscopiquement évalué montre une corrélation avec l’activité systémique de maladie de GvHD. Pour normaliser les résultats de l’évaluation mini-endoscopique de l’inflammation du côlon et pour assurer la comparabilité entre différentes souris et expériences au fil du temps, un site anatomique défini devrait être sélectionné pour la notation.
En plus de marquer l’inflammation du côlon, le canal de travail intégré dans la configuration mini-endoscopique permet la récupération de biopsies de tissus guidés par vue applicables à diverses analyses en aval, telles que l’histopathologie standard. En raison de la nature non invasive de la mini-endoscopie, la colite aiguë liée à la GvHD peut être évaluée à plusieurs reprises chez le même animal à pratiquement n’importe quel moment, donnant ainsi des aperçus fascinants de la GvHD intestinale.
