Cette mesure peut aider à répondre aux questions clés. Dans le domaine de l’humanologie. Cette réponse dans la fonction des macrophages dans la fin physiologique des conditions pathologiques.
Le principal avantage de cette technique est que la polyéthylène est enduite peut efficacement in vitro sans compromettre la cellule. Sous des doses optimales. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie et le diagnostic de beaucoup de désordres inflammatoires chroniques et cancers.
Où les macrophages jouent un rôle essentiel dans la pathogénie. La démonstration de la procédure sera Na Jia. Un étudiant diplômé de mon labo.
Et Kaixuan Wang, un étudiant diplômé du laboratoire du Dr Xiaohua. Pour préparer l’acide allylique modifié nanoparticules d’oxyde de fer super paramagnetic ou SPION d’abord ajouter 28 grammes d’hexahydrate de chlorure pharas. Et 20 grammes de pharas autoate heptahydrate à un bécher contenant 80 millilitres d’eau déionisée.
Et utiliser un conduit de verre pour introduire de l’azote dans la solution. Remuer jusqu’à ce que la matière solide soit dissoute. Chauffer le mélange de réaction à 72 degrés Celsius en remuant à 800 rotations par minute.
Et ajouter 40 millilitres d’eau ammoniaque à 28% au bécher. Après cinq minutes ajouter neuf millilitres d’acide allylique goutte sage. Et maintenir le mélange à 72 degrés Celsius pendant trois heures avec agitation continue.
À la fin de l’incubation refroidir la solution résultante à la température ambiante. Et précipiter le mélange par séparation magnétique selon les protocoles standard. Lavez ensuite le SPION contenant du précipité trois fois avec de l’alcool éthylique absolu.
Et asperse le précipité en 100 millilitres de n-hexane. Pour préparer l’acide acrylique dimercapto modifié SPION ajouter 800 milligrammes de l’acide allylic modifié SPION. Dispersés en 200 millilitres de n-hexane et 400 milligrammes d’acide acrylique dimercapto dispersés en 200 millilitres d’acétone dans un flacon à trois cous dans un bain d’eau à 60 degrés Celsius.
Ajouter ensuite 200 microlitres de triethylamine goutte sage à la fiole avec agitation à 1000 rotations par minute et reflux. Un précipité noir peut être obtenu par séparation magnétique après cinq heures. Ensuite, utilisez l’hydroxyde de tétraméthylammonium pour ajuster le pH de la solution pour la dispersion homogène des SPION hydrophiles dans l’eau déionisée.
La polyéthylènemine dégénérée enduite SPION’s ajouter l’acide acrylique dimercapto modifié spion solution colloïdale tomber sage dans une solution de polyéthylènemine de 10 kilodalton. Dans un flacon à trois cous de 500 millilitres sous agitation mécanique à 1000 rotations par minute pendant deux heures. À la fin de l’incubation ajouter la solution résultante à un tube de filtration ultra avec un poids moléculaire coupé de 100 kilodaltons et une teneur de 15 millilitres.
Centrafuse l’échantillon jusqu’à ce que la solution restante atteigne un volume d’un millilitre. Ajouter de l’eau déionisée à la solution pour ramener le volume à 15 millilitres. Et centrafuse et réhydrater la solution dix fois de plus comme vient de le démontrer.
Filtrez ensuite la solution à travers un filtre de 22 microns pour le stockage à quatre degrés Celsius. Pour préparer les nanoparticules de siRNA, ajoutez d’abord trois microlitres de solutions de siRNA de 20 micromolaires fraîchement préparées à cinq tubes microcentroafufusés libres d’ARN étiquetés. Et ajouter 0, 8, 1,6, 3,2 et 6,4 microgrammes de polyéthylènemine SPION à des tubes étiquetés zéro, un, deux, quatre et huit respectivement.
Après le mélange avec le pipetting doux, incuber les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux complexes de siRNA de spion de polyéthylènemine de se former. Et préparer un gel agarose de trois pour cent avec i pureté agarose. À la fin de l’incubation, ajouter un microlitre de tampon de chargement d’ADN de 6 X par cinq microlitres d’échantillon à chaque tube et mélanger soigneusement.
Ensuite, chargez tous les échantillons sur le gel. Et faire fonctionner l’électrophorèse à cinq volts par centimètre. Jusqu’à ce que le colorant bleu bromophénol migre deux tiers de la longueur sur le gel.
Un jour avant la transfection laver un microphage de souris comme RAW264.7 culture cellulaire avec PBS. Et traiter les cellules avec un millilitre de 25% trypsine pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Lorsque la majorité des cellules se sont détachées.
Inactivez la trypsine avec cinq millilitres de DMEN complet. Puis pippete la solution à plusieurs reprises pour disperser les grappes cellulaires. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conackel stérile de 15 millilitres pour centrifugation.
Puis suspendre à nouveau les cellules en cinq millilitres de DMEN complet frais pour le comptage. Diluer les cellules à 4,5 fois dix à la quatrième cellule par millilitre de concentration complète de DMEN. Et ajouter deux millilitres de milieu à chaque puits d’une plaque de six puits pour une incubation de 24 heures dans l’incubateur de culture cellulaire.
Le lendemain, préparez le rapport approprié de nanoparticules de polyéthylènemine SPION siRNA dans un tube de microcentrifugeuse de flux d’ARN de 1,5 millilitre avec mélange doux comme nous venons de le démontrer. Et ajouter le volume approprié de polyéthylènemine SPION siRNA complexe de nanoparticules à chaque puits qui a été remplacé par un millilitre de milieu frais. Préparer polyéthylènemine SPION si complexes.
dans ce cas, beaucoup plus de mois de polyéthylènemine SPION peuvent être utilisés minimisant ainsi leur toxicité potentielle. Puis faites tourbillonner soigneusement la plaque pour obtenir une distribution uniforme des nanoparticules à travers le fond du puits. Retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que la mise à jour cellulaire subséquente ou l’analyse de l’insuffisance de renversement de gène.
Polyéthylènemine SPION avec un potentiel zeta de 30,5 et 37 millivolts ne présentent pas une toxicité cyto apparente à des concentrations jusqu’à 30 microgrammes de fer par millilitre. Ce qui est environ deux fois la location que la concentration normalement utilisée pour la transfection cellulaire. Le potentiel zeta de Polyethyleneimine SPION de 48 millivolts est cependant toxique.
Même à la dose la plus basse examinée. Tel qu’analysé par cytométrie d’écoulement, plus de 90% des cellules peuvent être transfectées avec des complexes de siRNA polyéthylènemine SPION étiquetés fluorescentement à 15 microgrammes de fer par millilitre. L’évaluation des effets des concentrations de siRNA spion de polyéthylènemine sur l’internalisation cellulaire en écrasant la coloration bleue indique la coloration minimalement détectable à 7,5 microgrammes de fer par millilitre.
Mais des taches clairement visibles à 15 microgrammes de fer par millilitre qui n’augmentent pas à des concentrations plus élevées de fer probablement en raison de la saturation d’absorption de siRNA de polyéthylèneeimine SPION. Les macrophages péritonéaux transfectés avec le SPION de polyéthylènemine hébergeant le siRNA spécifique montrent une diminution significative des niveaux d’ARNm de targe comparés au siRNA non spécifique. Suggérant que siRNA peut échapper aux vésicules endocytiques dans le cytoplasme pour atteindre les machines d’interférence d’ARN.
Plus loin, après l’injection intraveineuse d’une seule dose de polyéthylène SPION siRNA complexes de nanoparticules flocentimetrical analyse de CD11b cellules positives et CD3 révèle une absorption plus efficace des nanoparticules par CD11b exprimant macrophages que par cd3 cellules positives à tout moment dans tous les organes examinés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer la polyéthylènemine SPION avec un potentiel moyen de données ne pas plus de 37 millivolts et de préparer les complexes polyéthylènemine SPION siRNA sur les faibles ratios fer à siRNA. Cette technique compare la nécessité pour les chercheurs d’explorer le potentiel thérapeutique de cibler le macrophage dans les moteurs animaux de maladies humaines telles que le cancer.
