L’objectif global du protocole est de générer un modèle humanisé de souris avec le système immunitaire humain fonctionnel et le foie utilisant les cellules souches hématopoïétiques humaines et le site d’hépato. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés chez les souris humanisées du foie génétique. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier l’immunopathologie causée par le VIH observée chez les personnes.
Yimin Sun, superviseur du département de pathologie et de microbiologie, ainsi que Weimin Wang et Edwrd Makarov, technologue de recherche, démontreront le processus. Pour commencer, transférez le sang ombilical de cordon recueilli dans les tubes héparinisés à un coffret stérile de flux laminaire. Ajouter le PBS jusqu’à ce que le volume soit porté à 35 millilitres.
Superposer l’échantillon sur le milieu de séparation des lymphocytes et le centrifuger 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 35 minutes sans pauses. Ensuite, retirez soigneusement la couche plasma supérieure et utilisez une pipette de transfert pour transférer l’interface de manteau blanc buffy à un nouveau tube. Suspendre à nouveau le pelage bouffi en tampon glacé de 30 à 40 millilitres.
À l’aide d’une pipette, combiner 20 microlitres de la suspension cellulaire avec 20 microlitres de bleu trypan de 0,4 %. Pipette 10 microlitres de ce mélange dans l’ouverture extérieure de l’une ou l’autre des deux chambres d’une diapositive de comptage, et insérer la diapositive dans un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules. Centrifuger les cellules à 300 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Aspirez soigneusement le supernatant et ajoutez 300 microlitres de tampon glacé. Ajoutez 100 microlitres de récepteurs FC humains bloquant le réagent et 100 microlitres d’anticorps cd34 anti-humains monoclonal s’est conjugué microbeads pour un total de 100 millions de cellules. Incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Ajouter 10 millilitres de tampon glacé pour laver les cellules et les centrifuger 300 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille dans 500 microlitres de tampon glacé. Après cela, placez une colonne LS de sélection positive dans le champ de tri cellulaire activé magnétique et passez-la à travers avec trois millilitres de tampon froid glacé.
Chargez l’échantillon dans la colonne LS qui peut piéger microbilles liées à des cellules humaines CD34 positives dans les échantillons, et lui permettre de couler sous l’influence de la gravité dans le tube de collecte. Lavez la colonne trois fois avec un tampon glacé et recueillez l’élitiste dans le même tube de collecte. Ensuite, plongez la colonne avec cinq millilitres de tampon glacé pour faire allusion aux cellules positives CD34 dans un nouveau tube de collecte.
Répétez la procédure pour atteindre une pureté de plus de 90%Suivant, utilisez un colorant bleu trypan et un hémomètre pour compter les cellules positives CD34 échappées. Après compter, centrifuger les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez les cellules dans 125 microlitres de PBS pour qu’une injection soit utilisée immédiatement dans la transplantation.
Pour vérifier la pureté de l’eluent positif CD34, prenez 50 microlitres de la suspension et incubez-le avec 10 microlitres d’anticorps CD34 anti-humains conjugués à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, laver et re-suspendre les cellules dans PBS et procéder à effectuer la cytométrie d’écoulement. Après l’acquisition, analyser les données telles qu’elles sont décrites dans le protocole texte.
Tout d’abord, récupérer et décongeler les hépatocytes cryopréservés tels qu’ils sont décrits dans le protocole de texte. Ensuite, retirez le bouchon biologique et versez les hépatocytes décongelés dans un tube conique de 50 millilitres contenant un milieu de décongélation réchauffé. Rock le tube à la main pendant quelques secondes pour suspendre les cellules.
Pelleter les cellules à 100 fois G et à température ambiante pendant huit minutes. Lavez les cellules granulées dans PBS avec 0,1%BSA et mettre en commun avec des HSPCs frais ou décongelés dans PBS à un volume final de 80 microlitres par souris. Tout d’abord, fixez une extrémité d’un tube d’extension stérile à une aiguille de calibre 30 et l’autre extrémité à une seringue d’un millilitre.
Remplissez la seringue de la suspension des HEP et des HSPC mis en commun. Adaptez la seringue dans l’encoche d’une pipette de distribution répétitive et ajustez le distributeur pour distribuer 10 microlitres dans chaque presse. Raser chaque souris comme indiqué dans le protocole de texte et frotter le côté gauche du corps de chaque souris avec 10% d’iode povidone suivi de 70% d’alcool isopropyle.
À l’aide de ciseaux de type Vannas, faire une petite incision dans la peau, le muscle et le péritoine à gauche de la paroi péritonéale pour entrer dans la cavité péritonéale à environ 5 millimètres sous le bord inférieur de la cage thoracique. Localisez la rate et utilisez des forceps pour la tirer légèrement vers la zone d’opération pour faciliter l’accès et insérez l’aiguille de calibre 30 dans le poteau inférieur de la rate. Ensuite, déverrouillez le piston de la pipette de distribution et distribuez 10 microlitres du volume à la fois, avec une limite de 60 à 80 microlitres par rate.
Rétractez l’aiguille lentement et coupez la rate avec des clips de ligature à l’aide d’une ligature plus appreuse. Ensuite, utilisez des applicateurs à pointe de coton mouillés avec du PBS stérile pour repousser la rate dans la cavité du corps. Utilisez un motif de suture interrompu pour fermer la couche musculaire de la paroi abdominale.
Accomplissez la fermeture de peau avec un modèle interrompu de suture utilisant des sutures non absorbables. Transférez tous les matériaux nécessaires à une installation désignée de niveau Deux Plus en matière de biosécurité. Portez de l’équipement de protection personnelle, y compris une housse jetable, toutes les robes, couvre-chaussures, masque facial et gants doubles, y compris des gants résistants aux coupures, en tout temps tout en travaillant avec le virus.
Choisissez des souris avec une reconstitution de plus de 15 % des cellules humaines cd45 positives et avec une présence d’albumine humaine dans le sérum pour l’infection par le VIH-1. Injectez intraperitoneally les souris avec 1.000 à 10.000 doses infectieuses de culture tissulaire de 50 HIV-1 ADA dans un volume de 100 à 200 microlitres par souris. Après avoir euthanasié les souris, exciser le foie de chaque souris tel qu’il est décrit dans le protocole texte.
Recueillir et fixer les foies dans 4% paraformaldéhyde pendant la nuit. L’établissement d’un modèle de souris humanisé double avec le foie humain et les cellules immunitaires peut être facilement surveillé à chaque étape avec ELIZA très simple et cytométrie d’écoulement, respectivement. La cytométrie des flux est régulièrement effectuée pour évaluer le développement d’un système immunitaire fonctionnel et pour voir l’effet de l’infection par le VIH sur les cellules immunitaires.
Chez les souris doublement humanisées, le développement de cellules immunitaires fonctionnelles peut varier de 15 à 90 % de la porte des lymphocytes. Pour l’évaluation de l’engraftment des hépatocytes humains, ELIZA pour des niveaux humains spécifiques d’albumine est exécuté mensuellement sur le sérum de souris. Les souris greffées à la fois avec des HSPCs et des HEP montrent des niveaux d’albumine spécifiques à l’homme allant d’environ sept microgrammes par millilitre à 377 microgrammes par millilitre à un mois, continuant à croître au fil du temps d’observation.
L’effet de l’infection par le VIH sur les cellules immunitaires humaines dans le sang des souris doublement humanisées est surveillé par cytométrie de flux et sur les HEP dans le foie par l’albumine spécifique à l’homme ELIZA. En cinq semaines, le VIH-1 entraîne une diminution des niveaux d’albumine humaine dans le sérum et il y a un épuisement des hépatocytes positifs CK18 humains dans les sections hépatiques des souris doublement humanisées. Un rapport plus faible de CD4 à CD8 est généralement observé dans le sang et le foie des souris infectées par le VIH, comparativement aux niveaux notés chez la même souris avant l’infection.
Le sang doit être superposé soigneusement sur le dessus du milieu de séparation des lymphocytes pour les isolements du pelage bouffi. Pour la chirurgie, maintenez la rate doucement et insérez l’aiguille dans le pôle inférieur de la rate. Après l’isolement des cellules souches hématopoïétiques, il est crucial de vérifier la pureté des cellules souches hématopoïétiques positives CD34 afin d’éviter les cellules cd3 positives et les injections aiguës d’hépatocytes de différents donneurs.
Comme les souris humanisées montrent un aspect physiologique du système immunitaire humain et du foie, les souris développées pourraient être utilisées pour étudier la physiopathogenèse du VIH et des infections physiques et de la cirrhose.
