Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biochimie telles que la taille, la forme et les changements conformationnels des biomolécules et de leurs complexes. Le principal avantage de cette technique est que les expériences peuvent être réalisées dans des conditions tampons physiologiquement pertinentes dans un environnement où les biomolécules sont stables. SAXS est une technique complémentaire à de nombreuses autres méthodes de biologie biophysique et structurelle.
La combinaison de SAXS avec ces méthodes peut nous aider à développer des thérapeutiques basées sur la structure. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des complexes biomoléculaires, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’étude des nanoparticules et des versicles d’administration de médicaments. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce qu’il apparaît comme un processus écrasant et compliqué, pour passer de données de diffusion brutes à des structures à faible résolution.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le pipeline d’analyse de données pour obtenir des modèles structurels à partir de données brutes est difficile à apprendre car il implique l’utilisation de nombreux paquets différents de logiciels. Il existe quelques logiciels qui sont utiles pour l’analyse des données SAXS. Il s’agit notamment de SCATTER, BioXTAS RAW et la suite ATSAS.
Dans cette vidéo, nous vous donnerons un aperçu des mesures générales à prendre lors de l’analyse des données SAXS brutes, à l’aide de la suite de programme ATSAS. Pour commencer, installez et chargez la suite de programme ATSAS. Ouvrez le programme PRIMUS/Qt et passez à l’option Menu ouvert.
Ici, sélectionnez jusqu’à 13 fichiers de données d’intérêt. Les fichiers de données doivent être dans le format ASCII, dans lequel la première colonne est l’axe s-vector et la deuxième colonne est l’intensité. Répétez cette étape pour les données tampon uniquement, en insérant ces données dans un deuxième menu Outils.
Ensuite, accédez à la fenêtre de traitement des données et sélectionnez Soustraire. Cela générera une courbe de diffusion soustrayée, représentant seulement la diffusion de la macromolécule d’intérêt. Pour effectuer l’analyse Guinier, commencez par une courbe de dispersion soustrayée tampon chargée dans PRIMUS/Qt.
Prochain clic sur Radius of Gyration, qui ouvrira le Primus Guinier Wizard. À ce stade, une parcelle montrant le journal naturel de l’intensité par rapport aux angles de diffusion au carré sera affichée. Pour obtenir un rayon préliminaire de gyration, trouvez la fenêtre Command Prompt et utilisez la fonction Autorg.
Après avoir poussé Autorg, cliquez sur la limite supérieure jusqu’à un, puis vers le bas un pour forcer le programme à mettre à jour les mesures statistiques. Alternativement, entrez plusieurs fichiers à la fois en cliquant sur la même invite ouverte et en sélectionnant plusieurs noms de fichiers de données en les mettant en surbrillance de la même manière que précédemment décrit. Pour commencer l’analyse Kratky, cliquez pour sélectionner le nom du fichier de données.
Cela permettra de tracer les données dans la fenêtre. Et puis, sélectionnez Plot. Ensuite, sous le bouton Plot, cliquez sur Kratky Plot.
En conséquence, les protéines globulaires affichent un pic GALC-ean tandis que les protéines dépliées afficheront un plateau au lieu d’un pic et ressembleront à une parcelle hyperbolique comme celle montrée ici. Le tampon de charge a soustrait des données pour chaque concentration dans PRIMUS/Qt une fois de plus. Et sous l’onglet Traitement, cliquez sur Échelle et inspectez chaque courbe et le nombre i-scale, qui est corrélé aux dilutions faites à partir de l’échantillon d’origine.
Après inspection, fusionnez les données en cliquant sur le bouton Fusion dans la fenêtre Traitement. Pour générer la parcelle de distribution à distance, chargez les courbes de données fusionnées dans PRIMUS/Qt, puis cliquez sur Distribution à distance dans l’onglet Analyse. Ajustez la plage de données des données fusionnées pour éviter tout bruit important à l’extrémité arrière des données brutes.
En outre, omettez les points de données près du beamstop dans la région de bas q en sélectionnant la valeur de gamme inférieure et en augmentant le nombre. Pour déterminer le Dmax, commencez par une plage de cinq fois le rayon de gyration obtenu à partir de l’analyse Guinier. Ensuite, diminuez graduellement cette valeur jusqu’à ce que la parcelle de distribution à distance ne tombe pas brusquement à zéro sur l’axe Y et n’a pas une longue queue avant de s’approcher de zéro.
Vérifiez que le rayon expérimental de gyration par rapport à la parcelle d’intensité, qui est dérivé de l’approximation de Guinier et du rayon de distribution à distance du gyration par rapport aux nombres d’intensité, est similaire. Ici, l’intensité de la lumière éparse est montrée tracée contre l’angle de diffusion, suggérant à la fois la qualité des biomolécules nidogen-1, laminine gamma-1 et leur complexe, ainsi que leur forme. La distribution de distance de paire d’électrons déterminée à partir des données de diffusion suggère que les biomolécules ont une forme allongée et la parcelle kratky suggère que les protéines sont dans un état plié, car les données ont tendance à plafonner, voire augmenter dans la plus grande gamme q et n’ont pas une forme de courbe de cloche.
En outre, les parcelles guinier, qui utilise des données à faible angle de diffusion, indique la région linéaire pour la détermination du rayon de gyration, qui est montré ici pour nidogen-1, laminine gamma-1 et leur complexe. Pour étudier les complexes protéines-protéines, MONSA a été utilisé pour obtenir la structure à basse résolution de l’ensemble du complexe gamma-1 de laminine nidogen-1, suggérant que seule la région c-terminale des deux protéines participe aux interactions de médiation alors que le reste des domaines sont éloignés les uns des autres. N’oubliez pas que le travail avec le rayonnement synchrotron peut être extrêmement dangereux et que les précautions et la sécurité décrites par chaque ligne de faisceau différente doivent toujours être prises lors de la collecte initiale des données.
