Cette méthode peut aider à répondre aux questions liées à l’efficacité, le rendement de récupération, et la pureté du fluide de lavage bronchoalveolar dérivé vésicules extracellulaires en utilisant une approche de centrifugation d’ultrafiltration. Nous avons directement comparé cette technique à une technique de purification du gradient d’ultracentrifugation et de densité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, efficace et adaptée aux petits échantillons de volume tels que le liquide de lavage bronchoalveolar murine.
Plus important encore, il fournit une pureté élevée et une évolutivité significativement plus élevée par rapport à une méthode d’isolation ultracentrifugation. M. Norman Garrett III, associé de recherche pour mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, insérez un angiocathéter de calibre 22 dans la trachée d’une souris euthanasiée.
Fixez une seringue à insuline avec un millilitre de DPBS stérile glacé et inculquez un millilitre dans les deux poumons. Retirez lentement le piston de seringue pour récupérer le fluide de lavage bronchoalveolar, ou fluide de BAL. Et distribuer le liquide BAL dans un tube conique sur la glace.
Après cela, tirez le liquide BAL de 25 souris et divisez-le en deux ensembles égaux. Centrifuger le liquide BAL à 400 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le supernatant et le centrifuger à 15 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Ensuite, recueillir le surnatant et procéder à l’isolement EV étapes immédiatement. Tout d’abord, filtrer le super natant à travers un filtre à seringue stérile de 0,2 micromètre. Après cela, équilibrer l’unité de filtre centrifuge avec dpbs stérile pendant 10 minutes.
Puis centrifugeuse l’unité centrifuge à 15 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Remplissez le filtre de 15 millilitres de liquide BAL. Et centrifugeuse à 3000 G pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius.
Après cela, laver le retentate avec 14 millilitres de DPBS stérile en pipetting doucement à plusieurs reprises. Centrifugez l’unité filtrante à 3000 G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour enlever le DPBS et concentrer le retentate. Pour recueillir les EV concentrés dérivés du liquide BAL, insérez un pipetter dans le fond de l’unité de filtre et retirez l’échantillon à l’aide d’un mouvement de balayage d’un côté à l’autre.
Ensuite, aliquot le fluide BAL dérivé EV et les stocker à moins 80 degrés Celsius. Sinon, commencez par transférer le supernatant acquis précédent dans un tube d’ultracentrifugeuse. Et centrifuger à 10 000 G pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius.
Ensuite, recueillir le supernatant et centrifugeuse. Jetez le supernatant et suspendez à nouveau la pastille EV dans 200 microlitres de DPBS. Après cela, mélanger la suspension EV avec 300 microlitres de 50% iodixanol solution de travail.
Et transférez-le dans un tube ultracentrifugeuse de 15 millilitres. Ajoutez ensuite la solution tampon selon le protocole de texte pour créer un gradient de densité flottant, et centrifugez-la à 100 000 G pendant trois heures et 50 minutes. Recueillir les fractions 15% et 25% iodixanol, et les diluer dans DPBS pour porter le volume jusqu’à 15 millilitres.
Transférer les fractions dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse et une centrifugeuse à 100 000 G à 4 degrés Celsius pendant 60 minutes. Jetez le supernatant et suspendez les granulés EV dans 50 microlitres de DPBS stérile. Pour commencer l’analyse de suivi des nanoparticules, diluer l’échantillon ev en un millilitre de DPBS.
Et charger l’échantillon dans une seringue à insuline. Après cela, fixez la seringue à une pompe à seringues et mesurez le nombre et la taille des particules. Réglez le niveau de la caméra à 14 et le seuil de détection à un.
Ensuite, utilisez un lecteur de plaque pour quantifier la quantité de protéines dans l’échantillon EV via la détection colorimétrique. Dissoudre une quantité égale de protéines EV de chaque échantillon avec un tampon de chargement de ballonnement et la TNT. Ensuite, chauffer les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Charger les échantillons dans un gel d’acrylamide Bis-Tris Plus et faire fonctionner l’électrophorèse pendant 35 minutes. Transférer ensuite les protéines dans une membrane de nitrocellulose à l’aide d’une méthode de transfert à sec. Après cela, bloquer la membrane avec cinq pour cent de lait écrémé pendant 60 minutes avec basculement doux.
Incuber la membrane avec un anticorps à un marqueur de protéines de surface EV à quatre degrés Celsius avec basculement doux pendant la nuit. Développez la membrane en incubant la membrane avec de l’anticorps de liaison HRP pendant 60 minutes à température ambiante. Lavez la membrane pendant 10 minutes avec le tampon TBST trois fois.
Enfin, développez la membrane avec un réaccageur de détection d’anticorps HRP chimioluminescent avant de passer à l’imagerie. Pour commencer la cytométrie d’écoulement, diluer le fluide BAL dérivé ev dans 49 microlitres de tampon de coloration PEB. Ajouter ensuite trois anticorps à chacun des échantillons, avant d’incuber les échantillons à quatre degrés Celsius avec basculement pendant 60 minutes dans l’obscurité.
Enfin, diluer les échantillons avec 40 microlitres de membrane filtrée PEB tampon de coloration et effectuer l’analyse de cytométrie de flux. Dans ce protocole, les EV ont été isolés du liquide BAL de souris utilisant des méthodes d’UFC et d’UC-DGC. Le liquide BAL dérivé des EV à partir de souris normales isolées par la méthode UFC affichait des tailles plus petites et une distribution de taille plus uniforme que celle de l’UC-DGC-EV.
La technique de l’UFC a également eu des nombres totaux de particules significativement plus élevés par rapport à la technique UC-DGC. La récupération totale des protéines mesurée en milligrammes de l’UFC-EV était également supérieure à celle de l’UC-DGC-EV, ce qui indique que la technique de l’UFC est plus efficace en temps et en efforts. Enfin, les EV dérivés du liquide BAL ont également été caractérisés par cytométrie d’écoulement.
Les CD63, CD9 et CD81 de l’UFC-EV et de l’UC-DGC-EV ont tous deux exprimé des CD63, CD9 et CD81. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de réhydrater la membrane de l’unité d’ultrafiltration avec DPBS. Une fois la membrane hydratée, l’appareil doit être maintenu humide en tout temps jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
La récupération du vésicule extracellulaire retentate de l’unité de filtre peut être difficile. Assurez-vous que la pointe pipette est balayée d’un côté à l’autre pour récupérer la plupart des EV de l’unité de filtre. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’isolement vésiculeux extracellulaire pour explorer les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires dérivées du lavage bronchoalveolar dans des conditions normales ou pathologiques chez les petits animaux.
